利用基因敲放技術(shù)建立胰島β細(xì)胞特異表達(dá)的Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型.pdf

1、β細(xì)胞是體內(nèi)胰島素的主要來源，在維持血糖平衡中起著關(guān)鍵作用。β細(xì)胞不僅僅是分泌胰島素的加工廠，而且還精細(xì)調(diào)節(jié)胰島素的分泌，使血糖在較窄的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。近年來，隨著人們生活水平提高及生活方式的改變，2型糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，進(jìn)行性β細(xì)胞功能衰減直至β細(xì)胞功能衰竭是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。對(duì)β細(xì)胞的研究也成為了糖尿病藥物治療研究的主要方向。
　　 條件性基因打靶是在常規(guī)基因打靶的基礎(chǔ)上，結(jié)合重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性

2、重組技術(shù)發(fā)展而來的一種基因打靶技術(shù)。它可以將對(duì)特定基因的修飾限制于特定類型的細(xì)胞、組織甚至小鼠發(fā)育的特定階段?；贑re/LoxP系統(tǒng)的條件基因打靶，通常借助同源重組將兩個(gè)LoxP位點(diǎn)置于靶基因中編碼重要功能域外顯子的兩側(cè)內(nèi)含子序列中，從而獲得表型正常的Flox小鼠;而后將該LoxP位點(diǎn)修飾的小鼠與細(xì)胞或組織特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交后，可望獲得組織特異性基因剔除小鼠。其中Cre重組酶只在特定的細(xì)胞或組織中表達(dá)，并且Cre/

3、LoxP位點(diǎn)依賴的重組會(huì)將該細(xì)胞中的靶基因剔除，而其它類型細(xì)胞中由于沒有Cre重組酶的表達(dá)，靶基因不會(huì)被刪除而仍然保持原有的表達(dá)模式。這樣，就為我們研究某些刪除后導(dǎo)致胚胎期致死的基因功能提供了很好的研究工具。
　　 基因敲除小鼠模型的應(yīng)用為研究哺乳動(dòng)物基因功能提供了可靠的方法。本研究以胰島素2基因(Ins2)的第三個(gè)外顯子為靶位點(diǎn)，利用新型的基于λ噬菌體Red重組系統(tǒng)的重組工程技術(shù)，構(gòu)建在胰腺β細(xì)胞中特異性表達(dá)Cre重組酶的基因

4、敲入型打靶載體，為獲得胰腺β細(xì)胞中基因特異性敲出小鼠模型提供關(guān)鍵材料。本研究以低拷貝質(zhì)粒pBR322為骨架構(gòu)建取獲載體(retrieving vector)，應(yīng)用缺口修復(fù)(Gap-Repair)的方法在λ噬菌體Red重組酶的作用下，通過同源重組亞克隆了長度約為12kb Ins基因;同時(shí)構(gòu)建一個(gè)帶有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列、Cre重組酶序列和正負(fù)向篩選標(biāo)記基因的微型打靶載體（mini-targeting vector），最后通過