人HMGB1-boxA基因克隆及其原核表達(dá)載體的表達(dá).pdf

1、目的： 高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)的核蛋白，該蛋白由215個(gè)氨基酸殘基組成，其N(xiāo)-端包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域：HMGB1-boxA和HMGB1-boxB，均由約80個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，呈較強(qiáng)的堿性，為與DNA非特異結(jié)合區(qū)[1]。 HMGB1釋放至胞外后，B盒是引起炎癥反應(yīng)的功能域，而A盒對(duì)B盒有一定的拮抗作用；核外HMGB1與DNA非特異性結(jié)合，親和力低，在細(xì)胞核內(nèi)參與細(xì)胞分化、DNA修復(fù)、DNA重組及類(lèi)固醇激

2、素調(diào)控等生命活動(dòng)。盡管HMGB1蛋白缺少引導(dǎo)肽，且不能穿出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基細(xì)胞器，但仍可通過(guò)活化細(xì)胞的主動(dòng)分泌和壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放進(jìn)入胞外。在胞外，HMGB1為一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子，是啟動(dòng)和維持炎癥瀑式反應(yīng)的中心分子，與膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、急性肺炎、肝炎、自身免疫性疾病等的發(fā)病機(jī)理關(guān)系密切。 胞外HMGB1需與相應(yīng)胞膜受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）與HMGB1具有高親和力，是HMGB1的主

3、要受體。HMGB1與RAGE結(jié)合后，可引發(fā)MAPK的磷酸化、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和活化蛋白-1的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使許多其它炎性因子如IL-1β、TNF-α、IL-8等表達(dá)加強(qiáng)和釋放增多而啟動(dòng)炎癥或使炎癥惡化[3]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)膿毒血癥患者的HMGB1水平顯著增高，且患者的HMGB1水平越高，其死亡的可能性越大。另外，HMGB1還是多種自身免疫性疾病的重要免疫原。HMGB1在炎癥中的核心地位表明HMGB1很可能成為疾病治療的有效靶點(diǎn)分子。

4、現(xiàn)有研究表明，在胞外，HMGB1的致炎作用主要是由其boxB結(jié)構(gòu)域來(lái)行使，并且單獨(dú)boxB即可發(fā)揮致炎作用。與此相反，單獨(dú)boxA則具有顯著抑制HMGB1及其boxB致炎作用的能力，現(xiàn)已成為HMGB1有效的拮抗劑?，F(xiàn)已研發(fā)了多種在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有明顯效果的HMGB1拮抗劑，但臨床效果有待研究。HMGB1從細(xì)胞中釋放的調(diào)節(jié)機(jī)制、HMGB1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還需要深入研究和闡明。本課題以此為思路，將HMGB1-boxA的基因克隆并在大腸桿菌表達(dá)，從

5、而得到純化的重組蛋白，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性打下基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果： 1.成熟人HMGB1-BOXA的基因克隆及序列分析 取正常人新鮮外周血，提取單個(gè)核細(xì)胞，用本室制備的RNA提取試劑盒分離純化細(xì)胞總RNA。以RNA為模板，隨機(jī)六聚體核苷酸為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA的第一鏈。根據(jù)HMGB1-boxA的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增成熟人HMGB1-boxA基因的一對(duì)引物，分別在上下游引物5'

6、端加上限制性酶切位點(diǎn)EcolRⅠ初BglⅡ。設(shè)計(jì)上游引物時(shí)，在成熟人HMGB1-boxA編碼序列的上游加上起始密碼子ATG，同時(shí)在上游加上保護(hù)性堿基GC，下游引物加上TA，降低G+C含量，防止二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)含量。以RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA為模板，用Tαg DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增HMGB1-boxA基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種于含100ug/mL氨

7、芐青霉素的LB平板。用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽(yáng)性克隆，采用ABI3100-Avant Genetic Analyzer全自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序，結(jié)果顯示，克隆的基因和預(yù)期的成熟人HMGB1-boxA基因完全一致。成功構(gòu)建了人HMGB1-boxA的重組質(zhì)粒pMD18-T/HMGB1-boxA。 2.人/HMGB1-BOXA基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重組蛋白的鑒定 用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切消化重組質(zhì)粒pMD18-T

8、/HMGB1-boxA，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化HMGB1-boxA片斷，插入原核表達(dá)載體pBV220的PL啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建重組HMGB1-boxA表達(dá)載體。重組子同樣用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽(yáng)性克隆，從而獲得重組陽(yáng)性質(zhì)粒pBV220-HMGB1-boxA。將重組的陽(yáng)性克隆株進(jìn)行誘導(dǎo)，用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)3-5小時(shí)，再于42℃誘導(dǎo)3-5小時(shí)后，離心集菌，做SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在9.9KD