NT3原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及精原干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:通過(guò)構(gòu)建高效表達(dá)載體pGEX-NT3的重組質(zhì)粒并在JM109宿主菌中進(jìn)行表達(dá),希望獲得具有生物活性的人NT3蛋白,為大量獲得重組人NT3純品打下一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).方法:首先通過(guò)正常人骨髓獲得全基因組DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增出NT3全序列;再經(jīng)雙酶切連接到表達(dá)載體pGEX-1λT中,構(gòu)建重組載體pGEX-NT3并轉(zhuǎn)化宿主菌JM109.通過(guò)酶切和自動(dòng)化測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的正確性.最后經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)NT3融和蛋白的

2、表達(dá).結(jié)果:通過(guò)PCR擴(kuò)增出NT3外顯子730bpDNA片斷;重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切檢測(cè)到與PCR相同大小的DNA片斷;經(jīng)自動(dòng)化測(cè)序除第198位堿基發(fā)生突變,其它序列與文獻(xiàn)報(bào)道完全一致.而含重組質(zhì)粒的宿主菌JM109經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE凝膠電泳,顯示有54kD的特異性融合蛋白條帶產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)菌體裂解液沉淀部分NT3融合蛋白含量較高.結(jié)論:成功構(gòu)建了人NT3原核重組表達(dá)載體pGEX-NT3,表達(dá)出人NT3融合蛋白,為獲得具有生物活性

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