共培養(yǎng)下內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴分離SD乳鼠背根神經(jīng)節(jié)，通過(guò)Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)高純凈度的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。⑵通過(guò)梯度密度離心的方法提取骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用EGM-2 MV培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得高純度內(nèi)皮祖細(xì)胞，為內(nèi)皮系細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。⑶通過(guò)建立內(nèi)皮祖細(xì)胞與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察共培養(yǎng)下內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)DRG細(xì)胞突起生長(zhǎng)的影響，為慢性脊髓損傷修復(fù)研究尋求新方向。
　　方法：①選取新生

2、SD大鼠，消毒后在手術(shù)放大鏡下摘取背根神經(jīng)節(jié)，搗碎后用胰蛋白酶消化，終止消化后用含100μg/ml鼠源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、0.1mg/ml L-谷氨酰胺、2％B27添加劑及青鏈霉素的不含血清Neurobasal培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，接種在提前用多聚賴(lài)氨酸包被處理過(guò)的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后全量換成含5μmol/L阿糖胞苷的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，48h后全量換成不含血清的 Neurobasal培養(yǎng)基，

3、之后每2d換液，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，取培養(yǎng)第6d的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行NSE免疫組織化學(xué)染色以行細(xì)胞鑒定。②選取SD大鼠，消毒后在超凈臺(tái)內(nèi)剝離下股骨、脛骨，用Hanks Buffer沖洗髓腔獲得沖洗液，添加淋巴細(xì)胞分離液應(yīng)用梯度密度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用內(nèi)皮系細(xì)胞專(zhuān)項(xiàng)培養(yǎng)基（EGM-2 MV）制成單細(xì)胞懸液，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)。96h后全量換液，后每3d換液，每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取誘導(dǎo)培養(yǎng)第6d的細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)

4、胞儀對(duì)細(xì)胞表面抗原CDl33、CD34、VEGFR-2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將培養(yǎng)至7d的細(xì)胞爬片通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì) Dil-ac-LDL的攝取及對(duì) FITC-UEA-1的結(jié)合能力，即分別從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面抗原表達(dá)和細(xì)胞功能學(xué)三個(gè)方面鑒定成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出高濃度的內(nèi)皮祖細(xì)胞。③分別按照實(shí)驗(yàn)一、二中的步驟進(jìn)行背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別選取培養(yǎng)第7d后的內(nèi)皮祖細(xì)胞與培養(yǎng)第4d的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分別接種于Transwe

5、ll上、下小室，中間隔以孔徑為0.3μm的聚碳酸脂膜。對(duì)照組Transwell上下室接種同實(shí)驗(yàn)組大致等量的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。置于同一細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2d全量換一次液，每日在倒置相差顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。在共培養(yǎng)后第2d、4d對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的隨機(jī)選取10個(gè)視野，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，通過(guò)Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞突起的數(shù)量、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度和平均突起長(zhǎng)度。
　　結(jié)果：⑴接種后的細(xì)胞懸液混濁，內(nèi)有多量雜質(zhì)存在。鏡

6、下觀察有神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和各種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。所有細(xì)胞呈圓形、體積較小，接種4h后可見(jiàn)部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁，神經(jīng)細(xì)胞胞體的周?chē)梢?jiàn)光暈。培養(yǎng)24h后細(xì)胞幾乎全部貼壁，可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞長(zhǎng)出小的突起，可見(jiàn)到數(shù)個(gè)神經(jīng)細(xì)胞成島狀存在。培養(yǎng)48h后，神經(jīng)細(xì)胞體積較前變大，不規(guī)則形狀，周?chē)黄鸬臄?shù)量增加，突起增粗變長(zhǎng)。加入阿糖胞苷培養(yǎng)48h后，貼壁的細(xì)胞數(shù)明顯減少，可見(jiàn)體積較大的死亡成纖維細(xì)胞漂浮存在。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞胞體體積逐漸增大，突起變長(zhǎng)并增粗，

7、互相連接，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得稠密。培養(yǎng)第7d，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞最為飽滿(mǎn)，突起極為豐富。繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不再飽滿(mǎn)，胞質(zhì)減少，突起停止生長(zhǎng)，突起逐漸彎曲、回縮，突起之間的連接部分?jǐn)嗔?，培養(yǎng)液中可見(jiàn)漂浮的細(xì)胞碎片。培養(yǎng)6d后的細(xì)胞行NSE免疫組織化學(xué)染色，陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色。純度檢測(cè)結(jié)果示，純度可達(dá)90%左右。⑵鏡下見(jiàn)剛接種的細(xì)胞均呈球形，折光性較強(qiáng)。培養(yǎng)2d后可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，可見(jiàn)少量細(xì)胞呈短的梭形。培養(yǎng)4d后，出現(xiàn)細(xì)胞突起，突起延

8、伸，偶然可見(jiàn)細(xì)胞集落形成，可見(jiàn)部分細(xì)胞呈線(xiàn)樣排列。培養(yǎng)7d后可見(jiàn)較多梭形細(xì)胞，有較明顯的集落形成，細(xì)胞呈典型的線(xiàn)樣排列。第14d可見(jiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞集落之間相互相連，呈典型的鋪路石樣改變。單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)EGM-2MV培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)示：細(xì)胞表型表達(dá)情況符合已知內(nèi)皮祖細(xì)胞抗原的表達(dá)特點(diǎn)。培養(yǎng)第7d的爬片細(xì)胞攝取 Dil-Ac-LDL的細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光，攝取FITC-UEA-1的

9、細(xì)胞胞質(zhì)被染成綠色熒光，合成圖像呈雙熒光染色陽(yáng)性（黃色）的細(xì)胞陽(yáng)性率>70％。雙染陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性為內(nèi)皮細(xì)胞的前體。⑶鏡下見(jiàn)培養(yǎng)1d后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相對(duì)比背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體折光性較強(qiáng)，突起較多。培養(yǎng)2d、4d后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相對(duì)比可見(jiàn)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起較長(zhǎng)，細(xì)胞之間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更緊密。在細(xì)胞共培養(yǎng)的第2d、4d，細(xì)胞共培養(yǎng)組中細(xì)胞突起的數(shù)量、最長(zhǎng)突起和平均突起長(zhǎng)度均較對(duì)照組有明顯增長(zhǎng)，兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

10、　　結(jié)論：①摘取新生乳鼠的背根神經(jīng)節(jié)，用Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò)48小時(shí)后加入阿糖胞苷來(lái)抑制雜志細(xì)胞的生長(zhǎng)，成功分離培養(yǎng)出了相對(duì)純凈度高的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。②應(yīng)用梯度密度離心法提取大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，接種后用EGM-2 MV培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，表面抗原鑒定及細(xì)胞功能學(xué)鑒定，表明提取的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可以獲得多量高純度的內(nèi)皮祖細(xì)胞。③共培養(yǎng)下EPCs能夠提高背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)能力，說(shuō)明內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)背根神經(jīng)節(jié)