前列環(huán)素對原代培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用的實驗研究.pdf

1、目的:1、通過一種無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)高純度的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實驗研究奠定基礎(chǔ)。2、通過應(yīng)用iloprost對培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察iloprost對神經(jīng)細(xì)胞軸突生長能力的影響。3、應(yīng)用iloprost對培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用，為臨床的慢性脊髓損傷后的修復(fù)研究尋求新的方法。
　　方法:1、選取新生24小時內(nèi)SD乳鼠作為取材對象，顯微鏡下取出背根神經(jīng)節(jié)，0

2、.25％的胰酶進(jìn)行消化，接種在0.2mg/ml多聚賴氨酸包被處理的培養(yǎng)板內(nèi)，用含濃度為100μ g/ml神經(jīng)生長因子(NGF)、2％B27添加劑、0.1mg/mlL谷氨酰胺，1％青鏈霉素的Nuerobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時后全量換液，用含5μmol/L阿糖胞苷的培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)48小時，此后每2天全量換液，取培養(yǎng)第5天的DRG細(xì)胞進(jìn)行NSE免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。2、將取出的背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行不同的處理后，分別進(jìn)行組織塊培

3、養(yǎng)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng):將DRG用0.25％胰蛋白酶消化5分鐘，制均勻的組織塊，分散接種在用多聚賴氨酸包被處理的6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后分成A組和B組培養(yǎng)，A組應(yīng)用含iloprost終濃度為20ng/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)，B組用不含iloprost的培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察比較兩組第3、5天時組織塊周圍突起數(shù)量、突起長度及最長突起長度。細(xì)胞培養(yǎng):按照方法1中的步驟進(jìn)行DRG取材、接種，然后分成C組和D組培養(yǎng)，C組應(yīng)用含iloprost終濃度

4、為20ng/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)，D組用不含iloprost的培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察比較兩組第3、5、11天時細(xì)胞突起數(shù)量、突起長度及最長突起長度。3、按照方法1中的步驟進(jìn)行DRG取材、接種，然后分成A、B和C三組培養(yǎng)，A組按方法1中步驟培養(yǎng)，B組用不含iloprost的培養(yǎng)基培養(yǎng)，C組用含iloprost終濃度為20ng/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)。用配置好的含阿霉素(ADM)終濃度為5mg/L的反應(yīng)液對培養(yǎng)5天后的B組和C組細(xì)胞進(jìn)行損傷處理4h。對三組

5、進(jìn)行TUNEL染色處理，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，計算細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:1、懸液細(xì)胞主要以神經(jīng)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為主。剛接種的細(xì)胞均呈圓形，4h后細(xì)胞即開始貼壁，培養(yǎng)24h，可見大部分細(xì)胞貼壁牢固，細(xì)胞開始長出突起，突起細(xì)長，并可觀察到突起末端的生長錐。用含阿糖胞苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后，可見細(xì)胞數(shù)目明顯減少，但神經(jīng)細(xì)胞突起的主干和分枝明顯延長并增粗，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密，神經(jīng)細(xì)胞胞體逐漸增大，細(xì)胞從球形變?yōu)槎喾N

6、形態(tài)后，形態(tài)保持相對穩(wěn)定。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示，顯色細(xì)胞大部分為陽性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色。純度檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)7天后的神經(jīng)細(xì)胞純度可達(dá)90％左右。2、在組織塊培養(yǎng)的第3、5天，iloprost干預(yù)組（A組）中組織塊周圍突起數(shù)目、突起長度和最長突起長度均較非干預(yù)組(B組)有明顯增長，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在細(xì)胞培養(yǎng)的第3、5、11天，iloprost干預(yù)組（C組）中細(xì)胞突起數(shù)目、平均突起長度和最長突起長度均

7、較非干預(yù)組（D組）有明顯增長，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、在A、B、C三組中均可發(fā)現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，在無iloprost處理組（B組）中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象最明顯，細(xì)胞凋亡率最高(62.81±5.04)％，C組凋亡率次之(54.78±5.12)％，A組凋亡率最低(0.44±0.03)％;ADM處理組(B和C組)細(xì)胞凋亡率與非ADM處理組（A組）比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。iloprost干預(yù)

8、組(C)細(xì)胞凋亡率與非iloprost干預(yù)組（B組）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、通過對24小時新生SD乳鼠取材，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時加入阿糖胞苷的方法可明顯抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長，獲得高純度的DRG神經(jīng)細(xì)胞。2、前列環(huán)素能夠提高組織塊及培養(yǎng)細(xì)胞軸突的生長能力，其對神經(jīng)細(xì)胞的作用，不僅僅是改變局部血流，增加局部神經(jīng)營養(yǎng)因子，而且本身還是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。它通過與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，提高細(xì)胞內(nèi)