結(jié)縷草(Zoysia japonica)抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZjDREB1基因的克隆、表達(dá)模式及功能分析.pdf

1、結(jié)縷草(Zoysia japonica)是目前正在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的主要暖季型草坪草之一，具有彈性好、耐踐踏、養(yǎng)護(hù)投入低等優(yōu)良坪用特性，是綠化、足球場(chǎng)草坪和高爾夫球場(chǎng)草坪的主要建群種。由于我國(guó)結(jié)縷草相關(guān)研究工作起步較晚，其功能基因的發(fā)掘和分子育種有待進(jìn)一步深入研究。為了揭示草坪草抗逆分子機(jī)制，獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良抗逆基因，本文在篩選抗寒性強(qiáng)的結(jié)縷草品種的基礎(chǔ)上，克隆其抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZjDREB1基因，并對(duì)其表達(dá)模式和功能進(jìn)行了分析

2、。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.以美國(guó)引進(jìn)的并在國(guó)內(nèi)外草坪生產(chǎn)上普遍應(yīng)用的結(jié)縷草三個(gè)優(yōu)良品種--Meyer、Palisades和蘭引3號(hào)為試驗(yàn)材料，通過(guò)葉片電解質(zhì)外滲法，利用半致死溫度(LT50)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，鑒定各品種的抗寒性。結(jié)果表明，三種結(jié)縷草品種的半致死溫度(LT50)分別為Meyer的-10.3℃、Palisades的-8.9℃和蘭引3號(hào)的-7.2℃。LT50值由低到高，推斷出抗寒性由強(qiáng)到弱依次為Meyer>Pal

3、isades>蘭引3號(hào)。
　　 2.根據(jù)結(jié)縷草近緣植物DREB轉(zhuǎn)錄因子的AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域序列，通過(guò)RT-PCR和RACE的方法從冷誘導(dǎo)的抗寒結(jié)縷草品種Meyer中擴(kuò)增到了一個(gè)新的DREB同源基因，命名為乃DREB1(GenBank登錄號(hào)：GQ848096)。該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)為774 bp，編碼257個(gè)氨基酸，分子量和等電點(diǎn)(pI)分別為28.85 kDa和5.53。序列分析表明，ZjDREB1推測(cè)的蛋白具

4、備DREB類轉(zhuǎn)錄因子的三個(gè)典型特征：AP2/EREBP保守DNA結(jié)合域，堿性核定位信號(hào)(NLS)和酸性激活區(qū)。根據(jù)氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，結(jié)縷草ZjDREB1與狗牙根BeDREB1、BeDREB2同源性最高，達(dá)84％，屬于DREB基因家族的A-2亞群。進(jìn)一步分離克隆了ZjDREB1的基因組DNA序列(GenBank登錄號(hào)為GQ864011)，分析發(fā)現(xiàn)其由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成。這是首個(gè)從結(jié)縷草中分離得到的DREB類轉(zhuǎn)錄

5、因子基因。
　　 3.為在研究乃DREB1基因的表達(dá)模式時(shí)提供分子內(nèi)參，采用RT-PCR和RACE技術(shù)擴(kuò)增出1560 bp的結(jié)縷草肌動(dòng)蛋白基因全長(zhǎng)cDNA序列。序列分析表明，該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)為1134 bp，編碼377個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)117 bp，3’非編碼區(qū)309 bp，分子量和等電點(diǎn)(pI)分別為41.72 kDa和5.23。所得序列與GenBank中收錄的其它植物肌動(dòng)蛋白核苷酸序列的一致性均在85％以上，

6、氨基酸序列的一致性高達(dá)97％以上。將其命名為ZjACT，GenBank登錄號(hào)為GU290545。根據(jù)高等植物肌動(dòng)蛋白相似性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，結(jié)縷草肌動(dòng)蛋白ZjACT與大麥Hvactin和圓錐小麥TtACT-1肌動(dòng)蛋白之間的親緣關(guān)系最為密切，在進(jìn)化中分化時(shí)間最為接近。進(jìn)一步分離克隆了結(jié)縷草Actin基因的基因組DNA序列(GenBank登錄號(hào)GU290546)，分析發(fā)現(xiàn)其由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。本研究有助于揭示植物Actin基因

7、家族的進(jìn)化歷史，為研究植物Actin基因家族功能和進(jìn)化上的多樣性奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為開(kāi)展草坪草和牧草Actin基因的功能分析和利用研究提供參考。
　　 4.以克隆得到的結(jié)縷草肌動(dòng)蛋白基因ZjACT為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析了三個(gè)結(jié)縷草品種ZjDREB1基因在冷脅迫處理下的表達(dá)差異。結(jié)果表明，室溫下ZjDREB1基本沒(méi)有表達(dá)。4℃處理1 h后，該基因開(kāi)始被誘導(dǎo)，并在持續(xù)的冷脅迫下表達(dá)量快速增加，處理6 h后，表達(dá)量達(dá)峰值

8、?？购詮?qiáng)的品種ZjDREB1基因的表達(dá)量始終高于抗寒性弱的品種。隨著溫度的降低，ZjDREB1的表達(dá)水平也隨之增高，0℃時(shí)的表達(dá)量要大于8℃的。進(jìn)一步的序列結(jié)構(gòu)分析表明，三個(gè)結(jié)縷草品種ZjDREB1基因的cDNA序列、基因組DNA序列和氨基酸序列都存在差異，推測(cè)是導(dǎo)致品種間表達(dá)模式顯著變化的可能原因之一。對(duì)不同品種間基因表達(dá)差異與冷耐受性的相關(guān)性研究，為揭示結(jié)縷草抗寒分子機(jī)制提供了依據(jù)。
　　 5.以已克隆得到的結(jié)縷草ZjDR

9、EB1全長(zhǎng)cDNA為模板，用引入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR方法獲得該基因的編碼框全長(zhǎng)，并將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-30a(+)上。重組載體pET-ZjDREB1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得含ZjDREB1基因的重組工程菌，進(jìn)而分析它在冷脅迫下可能具有的功能。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)獲得了分子量約為36 kDa的融合蛋白，大小與預(yù)期一致.在大腸桿菌的抗寒性試驗(yàn)中，與對(duì)照菌相比，表達(dá)ZjD

10、REB1融合蛋白的重組菌在低溫條件下表現(xiàn)出顯著提高的細(xì)胞活力，提示ZjDREB1蛋白可能具有提高大腸桿菌(很可能還包括其他生物)對(duì)低溫的抗性。由此推斷，ZjDREB1是潛在的可用于改良植物對(duì)環(huán)境脅迫耐受性的候選基因。
　　 6.將結(jié)縷草ZjDREB1基因?qū)胫参锉磉_(dá)載體pCAMBIA1301中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pCAM-ZjDREB1，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，并通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。T0代植株經(jīng)潮霉素抗性篩選得到10

11、株抗性苗。利用PCR和半定量RT-PCR技術(shù)再對(duì)抗性苗進(jìn)行分子鑒定，最終獲得5株陽(yáng)性植株。結(jié)果表明，結(jié)縷草ZjDREB1基因已整合到擬南芥基因組中，并在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。以電解質(zhì)滲漏法檢測(cè)了植株的抗寒性，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)ZjDREB1基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株(LT50=-8.6℃)的抗寒能力較野生型對(duì)照植株(LT50=-5.5℃)有明顯的提高。這些結(jié)果說(shuō)明ZjDREB1基因具有在草坪草和牧草抗逆基因工程改良中應(yīng)用的潛力。
　　 7.為

12、了改良重要的多年生暖季型草坪草假儉草(Eremochloa ophiuroides)的抗逆性，以莖段側(cè)芽來(lái)源的胚性愈傷組織為受體材料，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將結(jié)縷草耐逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZjDREB1基因?qū)爰賰€草優(yōu)良種質(zhì)E126中。分別就轉(zhuǎn)化體系中適宜的篩選劑濃度、抑菌素濃度、菌液濃度、侵染時(shí)間以及共培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行了研究，建立了高效的假儉草遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系。各種影響轉(zhuǎn)化效率因素的優(yōu)化試驗(yàn)表明，愈傷篩選和再生苗篩選的最佳潮霉素濃度

13、均為30 mg/L，頭孢霉素作為抑菌素的最佳濃度為400 mg/L，轉(zhuǎn)化時(shí)菌液濃度OD600為0.1-0.3、侵染30 min、共培養(yǎng)3 d為最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件，在侵染和共培養(yǎng)期間加入100μM乙酰丁香酮可提高轉(zhuǎn)化頻率。經(jīng)PCR、半定量RT-PCR和葉片的潮霉素抗性檢測(cè)，獲得了5株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株?？购澡b定表明，過(guò)表達(dá)ZjDREB1基因的假儉草轉(zhuǎn)基因植株的半致死溫度(LT50=-4.4℃)顯著低于野生型對(duì)照植株(LT50=-1.9℃)。初步證

14、明，ZjDREB1基因已整合到假儉草基因組中，可以作為后期轉(zhuǎn)基因假儉草植株抗性研究及培育轉(zhuǎn)基因假儉草新抗性品種的材料。
　　 8.為進(jìn)一步研究結(jié)縷草脅迫響應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中除DREB以外的其他關(guān)鍵基因(如COR、ICE、AREB/ABF、MYC/MYB、bZIP等)，揭示結(jié)縷草抗逆分子機(jī)制，建立結(jié)縷草功能基因組學(xué)研究基礎(chǔ)平臺(tái)，構(gòu)建了首個(gè)結(jié)縷草低溫和干旱誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫(kù)。以經(jīng)低溫、干旱處理的結(jié)縷草為材料，取其葉片提取總RNA并