大豆抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因GmDREB3的功能分析及啟動(dòng)子的克隆.pdf

1、干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。在這些非生物脅迫條件下植物表達(dá)了許多抗逆相關(guān)的基因，對(duì)抵御逆境脅迫作出應(yīng)答反應(yīng)。研究表明DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)低溫、干旱和高鹽脅迫的過(guò)程中起到重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室從大豆中克隆了全長(zhǎng)GmDREB3基因，研究證明GmDREB3基因受干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐性。為了分析GmDREB3基因在小麥中的表達(dá)特性，本研究采用基因槍法將GmDREB3基因轉(zhuǎn)

2、化栽培品種“石4185”，獲得15株轉(zhuǎn)基因小麥陽(yáng)性植株。T<,0>、T<,1.代轉(zhuǎn)基因小麥PCR檢測(cè)結(jié)果證明該基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化入小麥基因組中，并獲得穩(wěn)定遺傳。T<,1>代轉(zhuǎn)基因小麥抗旱性鑒定結(jié)果表明該基因的超表達(dá)能提高小麥對(duì)干旱脅迫的抗性。然而，對(duì)它們受低溫和脫水脅迫誘導(dǎo)的分子機(jī)制還不清楚。本研究為了在轉(zhuǎn)錄水平分析GmDREB3表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，采用SitFinding-PCR的方法從大豆基因組中分離了長(zhǎng)度為1921 bp的GmDREB3

3、基因啟動(dòng)子。GmDREB3啟動(dòng)子序列中富含A.T堿基，序列分析結(jié)果顯示，這些序列中含有大量的順式元件，除了’TATA盒等基本啟動(dòng)子元件外，還有低溫應(yīng)答響應(yīng)元件MYC、脫水應(yīng)答響應(yīng)元件MYB和ABA應(yīng)答元件ABRE等。為了確定激活基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)段和順式作用元件，利用PCR技術(shù)分段擴(kuò)增了GmDREB3啟動(dòng)子不同區(qū)段，將其分別連接到GUS報(bào)告基因上游，構(gòu)建了含有GmDREB3基因啟動(dòng)子不同區(qū)段-GUS基因的植物表達(dá)載體。采用基因槍法轉(zhuǎn)

4、化小麥愈傷組織，分別在不同的脅迫條件下處理轉(zhuǎn)基因愈傷組織，通過(guò)體外GUS組織化學(xué)染色和熒光分析實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GUS基因活性，根據(jù)GUS基因活性確定GmDREB3基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)段。鑒定結(jié)果表明，在干旱和低溫脅迫下，啟動(dòng)子-285～1648(相對(duì)于翻譯起始位點(diǎn))區(qū)段能夠激活GUS報(bào)告基因表達(dá)，-285～1117區(qū)段激活GUS基因的表達(dá)最強(qiáng)，-1117～1648區(qū)段對(duì)激活GUS基因表達(dá)的活性減弱。因此，推斷在-285～1117區(qū)段中存在