菊芋葉片過(guò)氧化物酶的分離純化及固定化研究.pdf

1、菊芋（Helianthus tuberoses L.）俗稱洋姜、鬼子姜，系菊科向日葵屬，多年生宿根草本植物。耐寒，耐旱，耐貧瘠，抗風(fēng)沙，適應(yīng)性廣，對(duì)土質(zhì)要求不嚴(yán)，原產(chǎn)北美洲，目前我國(guó)南北各地均有栽培。菊芋自根際發(fā)生地下莖，先端肥大而成塊莖，塊莖中干物質(zhì)含量高，是生產(chǎn)菊粉、高果糖漿、低聚果糖的理想原料?，F(xiàn)有研究均以菊芋塊莖為原料生產(chǎn)菊粉系列產(chǎn)品，而丟棄其地上莖葉部分，造成資源的巨大浪費(fèi)；也有些地方把菊芋地上莖葉部分作為牲畜的青飼料，因而經(jīng)

2、濟(jì)附加值很低。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道從菊芋葉中提取過(guò)氧化物酶。 過(guò)氧化物酶（Peroxidase, POD, 供體：H2O2 ，氧化還原酶，EC 1、11、1、7）是一類以正鐵血紅素IX為輔基的糖蛋白，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，不僅可作為標(biāo)記酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、免疫細(xì)胞組織化學(xué)和酶免疫測(cè)定，而且在蛋白質(zhì)、多肽、激素、病毒、神經(jīng)軸突傳遞研究、食品衛(wèi)生檢測(cè)、海關(guān)檢疫、工業(yè)“三廢”的處理、各類高分子材料的合成、木素降解等方面都有應(yīng)用?；谶^(guò)氧化物酶

3、獨(dú)特的穩(wěn)定性和優(yōu)良的反應(yīng)性能，甚至有人認(rèn)為，有朝一日，過(guò)氧化物酶可以作為“環(huán)境衛(wèi)士”在污染水和污染土壤的生物修復(fù)中大展宏圖；另外，過(guò)氧化物酶在催化合成聚酚以及芳香胺類物質(zhì)方面也有極大的應(yīng)用潛力：酶催化酚類物質(zhì)的聚合，獲得的聚酚類物質(zhì)是一種無(wú)甲醛存在的酚樹(shù)脂，從而可以消除樹(shù)脂在制造及使用過(guò)程中甲醛對(duì)環(huán)境造成的污染；而酚及芳胺類物質(zhì)形成的聚合物，由于具有л-л共軛的電子結(jié)構(gòu)，因此在光電材料方面顯示了極強(qiáng)的應(yīng)用潛力[37]。目前國(guó)內(nèi)外均從辣根

4、中提取辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），而我國(guó)所使用的過(guò)氧化物酶主要靠進(jìn)口。 本實(shí)驗(yàn)篩選從菊芋葉中提取、分離、純化POD的條件，并對(duì)菊芋葉片過(guò)氧化物酶（Helianthus tuberoses L.，leaves peroxidase; HLP）部分理化性質(zhì)進(jìn)行研究, 為開(kāi)發(fā)利用菊芋葉，擴(kuò)大POD來(lái)源提供參考依據(jù)；探究了HLP的固定化及應(yīng)用于尿糖試紙的制備，對(duì)HLP的應(yīng)用進(jìn)行研究，為POD

5、的理論研究和實(shí)際生產(chǎn)及菊芋資源的更合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。 1、從菊芋葉中提取、分離、純化POD可行性的探討對(duì)比了菊芋葉、竹筍殼、甘蔗葉、豆殼四種材料提取的原酶液的酶活，發(fā)現(xiàn)HLP酶活（5.838×103U/g）略比竹筍殼（5.859×103U/g）、甘蔗葉（6.401×103U/g）低，但比豆殼（4.038×103U/g）高；且同工酶電泳顯示HLP與HRP分子量（Mr）不同、所帶電荷不同，含酸性氨基酸較多的酶，因此HLP可

6、作為不同于HRP的POD新酶源；而后對(duì)不同時(shí)期、不同部位的HLP酶活進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)幼苗期、開(kāi)花期、成熟期等幾個(gè)時(shí)期的葉片中，開(kāi)花期的葉片活性最高；在同一植株不同部位的葉片中，靠近植株中部葉片活性最高，根部衰老葉片次之，上部幼葉活性最小，電泳結(jié)果表明幼葉與老葉酶活性較低，可能與同一種POD酶活性降低以及有些同工酶在幼葉中未合成或在老葉中已分解有關(guān)；因而提取酶時(shí)應(yīng)選擇植株中部葉片和根部衰老葉片為宜。綜上所述，利用菊芋葉提取POD是可行的。

7、 2、HLP的提取、硫酸銨粗分離及純化流程的篩選結(jié)果表明：應(yīng)用pH6.8，0.1mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液提取；粗分離的硫酸銨飽和度為50﹪～90﹪；純化步驟用葡聚糖凝膠G-75（Sephadex G-75）；得到層析純的HLP，純化后有五條酶帶，較原酶液提純了16.2倍，酶活力回收率為22.4﹪。另外探討陰離子瓊脂糖離子交換劑（DEAE-Sepharose Fast Flow）的純化效果，同工酶電泳顯示經(jīng)DEAE

8、-Sepharose Fast Flow純化后有三條酶帶，說(shuō)明純化后的HLP有三種同工酶，。 3、層析純的HLP的部分性質(zhì)測(cè)定用葡聚糖凝膠G-75測(cè)定Mr發(fā)現(xiàn)HLP的Mr約為23600；光譜學(xué)分析揭示，在320nm處有一典型的Soret帶；發(fā)射光譜顯示在310nm和510nm處有兩個(gè)明顯發(fā)射峰；酶反應(yīng)的最適pH在5.0左右；最適溫度為40℃；50℃保溫1h酶活性基本無(wú)變化，60℃保溫1h后，酶活損失22.9﹪，70℃時(shí)可保溫3

9、0min酶活損失約50﹪； 80℃能保持酶活5min，結(jié)果表明菊芋POD耐熱性較好；于4℃冰箱中保存一個(gè)月后酶活基本不變，三個(gè)月后酶活仍有最初的60﹪左右，說(shuō)明所制得的HLP穩(wěn)定性較好。Mn2+、Fe2+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用，F(xiàn)e3+、K+略有抑制作用，而金屬離子Na+、NH4+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活力無(wú)顯著影響，Ca2+、Ba2+、Sn2+略有促進(jìn)作用。 4、對(duì)HLP的應(yīng)用的研究（1）固定化HLP 選用PVA-CA-戊二

10、醛包埋交聯(lián)法和D201大孔徑吸附樹(shù)脂吸附交聯(lián)法兩種方法固定化HLP，并采用正交試驗(yàn)對(duì)D201大孔徑樹(shù)脂吸附交聯(lián)法進(jìn)行優(yōu)化條件的篩選。結(jié)果表明：兩種固定化方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，PVA-CA-戊二醛包埋交聯(lián)法的活力回收為42.93﹪，大孔徑吸附樹(shù)脂吸附交聯(lián)法活力回收為56.7﹪，前者比后者低；但重復(fù)使用10次后，前者酶活保留63.64﹪，后者酶活保留約50﹪；說(shuō)明前者重復(fù)使用性比后者好。并對(duì)兩者的部分性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)固定酶的性質(zhì)與游離酶有所不