蕹菜葉片過氧化物酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及固定化研究.pdf

1、過氧化物酶(Peroxidase，POD，EC1.11.1.7)是一類在生物體內(nèi)普遍存在的、由單一肽鏈和鐵卟啉組成的血紅蛋白類氧化酶，催化由H2O2參與的氧化反應(yīng)，例如參與胺類和酚類化合物的氧化反應(yīng)。POD在生物體內(nèi)發(fā)揮多種重要功能，例如參與分解吲哚乙酸、合成木質(zhì)素和植物體內(nèi)防御反應(yīng)。當(dāng)今，該酶不僅廣泛用于免疫印跡、酶聯(lián)反應(yīng)和電鏡技術(shù)等生物學(xué)研究，而且在污水處理、生物傳感器等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
　　以新鮮蕹菜為原料，經(jīng)過勻漿、靜置

2、抽提、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析和Superdex-200凝膠過濾層析等步驟，分離純化獲得電泳純的蕹菜POD。該酶的比活力為35972.96U/mg，回收率為12.21％，純化倍數(shù)達168.48。經(jīng)過SDS-PAGE以及Superdex-200凝膠過濾層析，測定該酶的相對分子質(zhì)量約為42.7KD。
　　用過氧化氫及愈創(chuàng)木酚作底物測定蕹菜過氧化物酶的酶活，發(fā)現(xiàn)該酶最適溫度為40℃，最適pH值6，并且在2

3、0～50℃及pH5～8的范圍內(nèi)具有良好的的穩(wěn)定性。以不同濃度的H2O2為底物，測得該酶的Km值為18.32mmol/L。NaCl、Urea、Zn2+、Mg2+對該酶都具有較強的激活作用，SDS，KSCN、AsA、Ba2+、Mn2+、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和異丙醇對蕹菜POD活力均有抑制作用，其中AsA對POD有極強的抑制作用，當(dāng)濃度為0.01mol/L時，酶活力接近為0。
　　選擇特定的化學(xué)修飾劑，分別用乙酰丙酮、二硫蘇糖醇

4、、氯汞苯甲酸、順丁烯二酸酐、氯胺-T、苯甲基磺酰氯、N-乙酰咪唑和溴乙酸選擇性地對其進行化學(xué)修飾，并且測定修飾前后酶活力變化。結(jié)果表明:精氨酸殘基、賴氨酸殘基、組氨酸殘基和巰基是蕹菜過氧化物酶發(fā)揮活性的必需基團，而甲硫氨酸硫醚基、絲氨酸殘基和酪氨酸酚羥基可能不是蕹菜過氧化物酶活性中心的必需基團。
　　利用0.2％ PVA-CA作載體，飽和硼酸作交聯(lián)劑，CaCl2作固定劑固定蕹菜POD，通過單因素試驗探究了各個因素對固定化的影響;再