HES-SPION磁共振對比劑的制備及應(yīng)用研究.pdf

1、近幾十年來，超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPION)的合成制備及其在在化學(xué)化工、材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用研究都有了長足的發(fā)展。SPION獨特的超順磁性、低毒性及良好的生物相容性使其在生物醫(yī)學(xué)中有了廣泛的應(yīng)用，如磁共振成像(MRI)、磁熱療、細(xì)胞標(biāo)記和成像以及藥物靶向轉(zhuǎn)運等。但同時，SPION的使用也會產(chǎn)生相關(guān)的毒性問題，如誘發(fā)氧化應(yīng)激、影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、改變基因表達(dá)譜和干擾體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)平衡等。本論文利用所制備的羥基乙淀粉(HES)包覆的

2、生物相容性SPION，研究了不同表面修飾后SPION的體內(nèi)分布、代謝以及腫瘤MRI效果，并使用系統(tǒng)毒理學(xué)方法對SPION的毒性進(jìn)行了初步探討。主要研究結(jié)果如下：
　　(1)開發(fā)了一種使用羥乙基淀粉(HES200/0.5)包覆制備水溶性SPION的方法，此方法可以放大合成，實現(xiàn)SPION的單次大劑量制備。制備得到的SPION在水中溶解性好，水合粒徑為33.65±0.92nm，zeta電位為-6.60±0.38mV(pH7.2)。在弱

3、酸性和堿性溶液中此SPION穩(wěn)定性良好，同時其水溶液以及PBS溶液在密封條件下保存36個月仍保持穩(wěn)定。此SPION在室溫時還具有良好的超順磁性，磁化率好，沒有剩磁，磁飽和強度為62.60emu/g，橫向弛豫率R2為45.73mM-1s-1，在低靜脈注射劑量(0.5mg Fe/kg)時即有明顯的小鼠肝臟MRI T2加權(quán)成像效果。
　　(2)基于SPION的電負(fù)性，使用帶正電的陽離子多肽如聚左旋賴氨酸(PLL)等與SPION組裝得到S

4、PIO-PLL納米簇(nanoclusters,NCs)。TEM顯示此納米簇為球形，且可以通過調(diào)控PLL和SPION的用量精確調(diào)控SPIO-PLL NCs的粒徑大小。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SPIO-PLL NCs的R2值與其粒徑在30~140nm的范圍內(nèi)是正相關(guān)的。使用小鼠原位肝癌模型靜脈注射(0.5mg Fe/kg)粒徑分別約為33、80和120nm的SPIO-PLL NCs后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中1~2mm大小的原位腫瘤均能在MRI T2影像中被

5、清晰區(qū)分出來。相較而言，粒徑約為120nm的SPIO-PLL NCs對肝臟中T2信號的增強最大。而正常小鼠以相同劑量注射此三種樣品，24h后各臟器中SPION分布即基本恢復(fù)到正常水平，顯示出良好的組織清除率；而在靜脈給藥11天后，大部分SPION可以經(jīng)尿液外排，且PLL的組裝有利于增加SPION的外排效果，顯示低劑量注射SPION的良好安全性。
　　(3)考慮到高劑量注射SPION引起的鐵過載對于肝臟，尤其是對已經(jīng)病變的肝臟會產(chǎn)生

6、嚴(yán)重的毒副作用，本論文進(jìn)一步使用系統(tǒng)毒理學(xué)方法考察不同劑量的SPION對肝臟的影響。分別以高(5.0mg Fe/kg)和低(0.5mg Fe/kg)兩種劑量靜脈注射后，發(fā)現(xiàn)高劑量SPION注射會引起肝硬化小鼠一些血生化指標(biāo)在24h后出現(xiàn)應(yīng)激性變化，如肝功能指標(biāo)ALT、AST和AKP等明顯升高，脂質(zhì)代謝指標(biāo)CHOL、HDL-C和LDL-C等明顯下降，即發(fā)生急性毒理學(xué)反應(yīng)，且在給藥14天后其脂質(zhì)代謝和血清鐵水平仍不正常，顯示出鐵過載對肝硬化

7、肝臟的長期毒副作用。雖然此劑量也導(dǎo)致正常小鼠肝功能指標(biāo)于48h后應(yīng)激性升高，但其水平隨時間有效下降，到14天后完全恢復(fù)正常。低劑量注射SPION對肝臟則沒有明顯的毒副作用。RT2PCR分子毒理學(xué)分析結(jié)果表明，SPION導(dǎo)致的鐵過載對肝硬化肝臟相關(guān)毒理學(xué)通路基因表達(dá)的影響與正常肝臟完全不同，主要表現(xiàn)為肝硬化肝臟中脂質(zhì)代謝被加強、鐵代謝失衡以及肝功能受損，顯示出對肝硬化肝臟的潛在長期毒副作用。這一結(jié)果表明，SPION作為臨床MRI對比劑使用

8、時，必須考慮給藥對象的組織功能和MRI成像效果，優(yōu)化給藥劑量，盡量減少SPION引起的鐵過載對病人組織功能的負(fù)擔(dān)以及損傷。
　　(4)基于高劑量SPION的潛在毒性，本論文最后初步探討了SPIO-PDL-pHLIP NCs的特異性腫瘤靶向效果，以期為減少SPION對正常組織的影響提供一種解決方案。pHLIP是一種靶向腫瘤組織酸性微環(huán)境的細(xì)胞膜穿透肽，PDL（poly-D-lysine，聚右旋賴氨酸）在生物體內(nèi)的不可降解性可以延長此

9、納米簇在體內(nèi)轉(zhuǎn)運時保持整體性的時間。結(jié)果顯示，60nm左右的SPIO-PDL-pHLIP NCs有最高的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)富集總量，而大粒徑（約80、100和120nm）的SPIO-PDL-pHLIP NCs的靶向效果明顯下降。此外，60nm的SPIO-PDL-pHLIP NCs在Bel7402、B16F1和H22等3種皮下瘤均有較好的靶向效果，表明SPIO-PDL-pHLIP NCs體系可能適用于多種腫瘤及其它具有微酸性環(huán)境疾病的診斷

10、和載藥治療。
　　綜上所述，本論文介紹了一種大劑量制備水溶性SPION的新方法，制備得到的SPION有良好的實際臨床肝癌診斷應(yīng)用前景。所制備的SPION在低劑量時表現(xiàn)出良好的MRI T2加權(quán)成像效果，其組織清除速率快，且可隨尿液外排。但在非診斷用的高劑量靜脈給藥時，SPION引起的鐵過載會對肝硬化肝臟造成潛在的長期毒性，引起肝臟脂質(zhì)和鐵代謝失常，甚至造成肝功能損失，但是對正常肝臟無不良效應(yīng)。本論文最后介紹了一種以腫瘤組織酸性微環(huán)境