利用果蠅模型研究pygo新型信號(hào)途徑.pdf

1、wg/Wnt信號(hào)在心臟發(fā)育和心臟衰老過程中發(fā)揮重要的作用。pygo作為Wnt信號(hào)途徑的一個(gè)新成員，依賴于Wnt信號(hào)調(diào)控心臟發(fā)育。本研究室的最新結(jié)果表明，敲低pygo表達(dá)導(dǎo)致嚴(yán)重的成體心臟功能突變表型，而敲低Wnt/β-catenen-TCF信號(hào)成員的表達(dá)導(dǎo)致的突變表型，明顯低于pygo的表型水平或無表型。另一方面，TCF的顯性負(fù)突變引起與pygo表型一致的嚴(yán)重成體心臟生理功能缺陷，提示pygo調(diào)控成體心臟功能不依賴于經(jīng)典Wnt信號(hào)，可能

2、依賴與TCF類似因子相互作用而發(fā)揮功能，存在新的調(diào)控機(jī)制。因此，利用果蠅心衰模型，探究新型的pygo分子調(diào)控途徑成為了我們的研究重點(diǎn)。
　　為了探究pygo在果蠅成體心臟中的分子調(diào)控機(jī)制，本文采用了染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序(CHIP-seq)的方法鑒定pygo基因調(diào)控成體心臟功能的新靶點(diǎn)，首先，運(yùn)用成體心臟功能分析系統(tǒng)驗(yàn)證了pygo在維持成體心臟功能中的重要功能。其次通過果蠅雜交實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了心臟特異性（hand4.2 Gal4

3、）驅(qū)動(dòng)UAS-HA-pygo過表達(dá)標(biāo)簽穩(wěn)定系，采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法證明了HA抗體的有效性，檢測(cè)到Pygo蛋白在心管的表達(dá)。同時(shí)，剝?nèi)∵^表達(dá)果蠅品系心管，用甲醛交聯(lián)，并用超聲波將其打斷成一定長度的小片段，取一部分染色質(zhì)作為Input，其余分別加特異性HA抗體，以及陰性對(duì)照IgG抗體，解交聯(lián)，純化DNA，最后對(duì)文庫DNA進(jìn)行驗(yàn)證、質(zhì)檢、高通量測(cè)序。測(cè)序后對(duì)結(jié)果進(jìn)行多方面處理，去污染及接頭、將測(cè)序轉(zhuǎn)化為可視化數(shù)據(jù);通過MACS方法追蹤到799

4、個(gè)重要基因組特征峰值，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分類，使用最新的UCSC瀏覽器對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能注釋;對(duì)峰值信號(hào)進(jìn)行GO富集聚類分析，Pygo相互作用基因的功能主要定位在染色體結(jié)構(gòu)變化和修飾過程中;分析轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS附近的峰值分布特征并對(duì)三個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行啟動(dòng)子峰值交叉分析，找到120多個(gè)代表基因;并對(duì)三個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行信號(hào)通路分析，定位到11條重要的信號(hào)通路。通過綜合分析我們初步定位到26個(gè)Pygo蛋白可能調(diào)控的候選基因。目前，候選基因的