利用小鼠過(guò)表達(dá)模型研究hHole和Pygo1基因在病理性心肌肥厚發(fā)生中的作用.pdf

1、病理性心肌肥厚(Pathological Cardiac Hypertrophy，PCH)是臨床各類(lèi)心臟疾病發(fā)展終末期的一個(gè)共同病理過(guò)程。據(jù)報(bào)道，該疾病在全球范圍內(nèi)的人群發(fā)病率約0.2％，在我國(guó)的成人群體中發(fā)病率約0.18％，約100萬(wàn)患者，且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。PCH的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因、多通路、多環(huán)節(jié)及多層次，迄今至少已發(fā)現(xiàn)有20個(gè)基因1400多種突變與PCH的發(fā)生相關(guān)。但仍有許多調(diào)控基因有待鑒定，其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制亦有待闡明。<

2、br>　　hHole與Pygo1均是在脊椎動(dòng)物成體心臟組織中特異性高表達(dá)的基因，我們的前期研究結(jié)果顯示在人類(lèi)心衰的心肌標(biāo)本中，hHole和Pygo1的均出現(xiàn)異常表達(dá)，然而對(duì)于hHole和Pygo1基因功能的研究，尤其是在心臟中的功能研究，迄今國(guó)際上尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此本文首先應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對(duì)人HOLE及人PYGO1蛋白的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)遺傳修飾手段構(gòu)建心肌特異性過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，旨在通過(guò)

3、建立hHole和Pygo1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，分別探討hHole和Pygo1在PCH發(fā)生中的作用，并進(jìn)一步闡明其潛在的作用機(jī)理。
　　一、心肌特異性過(guò)表達(dá)hHole阻遏ISO誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚
　　Hole基因作為一個(gè)在心臟發(fā)育和成體期均有高表達(dá)的基因，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)十多年，但國(guó)際同行們似乎一直忽視了它在體內(nèi)的生物學(xué)功能，Hole基因的生物學(xué)功能迄今仍是一片空白。我們的前期研究結(jié)果揭示，HOLE蛋白具有ERK結(jié)合位點(diǎn)(D-d

4、omain)和結(jié)合SH3結(jié)構(gòu)域的多聚脯氨酸序列(PXXP)，且上述結(jié)構(gòu)域?qū)RF肥大信號(hào)具有一定的抑制作用。此外，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)人類(lèi)hHole基因（TMEM121）內(nèi)部PXXP位點(diǎn)的SNP與人類(lèi)先天性心臟病存在一定的相關(guān)性，似乎使得hHole基因在心臟中的功能變得可以預(yù)知。
　　在前期研究中，我們還發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)擴(kuò)張型心肌病患者中，hHolemRNA表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步在體內(nèi)外水平分析心肌肥厚的小鼠模型及心肌細(xì)胞肥大的細(xì)胞模型中Hole的

5、表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Hole在mRNA和蛋白水平較對(duì)照組均有顯著升高，上述研究結(jié)果提示Hole可能參與病理性心肌肥厚的調(diào)控。
　　為研究hHole基因在病理性心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，我們首先應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)人類(lèi)hHole基因的基本結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，其次，為從實(shí)驗(yàn)水平驗(yàn)證人類(lèi)hHole基因的相關(guān)功能，我們應(yīng)用體內(nèi)遺傳修飾手段，首次建立了心臟特異性hHole過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠在正常的生理?xiàng)l件

6、下，表型正常，但效應(yīng)于異丙腎上腺(ISO)刺激，轉(zhuǎn)基因的小鼠較WT小鼠表現(xiàn)出抵抗ISO誘發(fā)的心肌肥厚，具體表現(xiàn)為心肌細(xì)胞面積的細(xì)微變化輕微的心肌纖維沉積、良好的心功能輸出等。上述結(jié)果初步證實(shí)hHole基因可能是PCH的抑制因子，我們的研究結(jié)果首次從分子水平上揭示hHole基因在脊椎動(dòng)物成體內(nèi)的生物學(xué)功能。
　　為深入研究hHole抑制病理性心肌肥厚的作用機(jī)理，我們進(jìn)一步應(yīng)用qRT-PCR方法分析TG小鼠中MAPK家族成員在mRNA

7、水平的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISO刺激的轉(zhuǎn)基因小鼠中ERK1，ERK2的mRNA表達(dá)水平均有下調(diào)，JNK或P38在mRNA水平則無(wú)顯著性變化。進(jìn)一步應(yīng)用WB方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中p-ERK及t-ERK的表達(dá)變化，結(jié)果顯示:效應(yīng)于ISO刺激，心肌特異性過(guò)表達(dá)hHole可顯著抑制ERK1/2的磷酸化。上述研究結(jié)果提示hHole可能通過(guò)ERKs信號(hào)途經(jīng)在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平雙重調(diào)控病理性心肌肥厚。
　　二、心肌特異性過(guò)表達(dá)Pygo1自主調(diào)

8、控病理性心肌肥厚
　　果蠅Pygopus基因是2002年發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典WNT信號(hào)通路的關(guān)鍵成員。具有調(diào)控組織發(fā)育、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄激活等多種重要生物學(xué)功能在脊椎動(dòng)物中Pygopus有兩種同源基因，分別是Pygopus1和Pygopus2(Pygo1, Pygo2)。在成體小鼠中，Pygo2基因在多種組織中廣泛表達(dá)，但Pygo1僅在心臟組織中特異性高表達(dá)。目前對(duì)Pygo1的研究相對(duì)甚少，其在脊椎動(dòng)物成體心臟中的功能研究更是一片空白。

9、r>　　Pygo1基因在成體心臟中特異性高表達(dá)是否提示其可能與心臟功能密切相關(guān)？前期研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)心肌肥厚患者中PGYO1蛋白表達(dá)異常升高，心肌肥厚小鼠模型中Pygo1在mRNA和蛋白表達(dá)與“胚胎基因”ANF、β-MHC、SK-α-actin的表達(dá)呈一致性上調(diào)。進(jìn)一步在體外細(xì)胞水平的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Pygo1的細(xì)胞系無(wú)需其它病理性肥厚刺激因子，即表現(xiàn)出細(xì)胞體積的增大和肥厚“標(biāo)志基因”的上調(diào);而在干擾Pygo1表達(dá)的細(xì)胞系中，被干擾細(xì)

10、胞系可抑制由ISO或胎牛血清誘導(dǎo)的心肌肥大。以上結(jié)果提示Pygo1基因可能是調(diào)控PCH發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵性作用因子。
　　為深入研究Pygo1的生物學(xué)功能，我們首先應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)人類(lèi)Pygo1基因的基本結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。其次，為進(jìn)一步證實(shí)該基因在動(dòng)物整體水平的表達(dá)效應(yīng)，我們將Pgyo1基因構(gòu)建在α-MHC啟動(dòng)子之下，并通過(guò)囊胚注射獲得了過(guò)表達(dá)Pygo1的轉(zhuǎn)基因小鼠后代，初步研究發(fā)現(xiàn)不需要任何肥大病理因子的刺激，P

11、ygo1過(guò)表達(dá)成年小鼠中的“胚胎基因”ANP、β-MHC、SK-α-actin在mRNA水平的表達(dá)顯著性上調(diào)，并伴有心肌細(xì)胞體積的增大及年齡相關(guān)的心肌纖維化等。我們的研究結(jié)果首次揭示Pygo1基因可自主調(diào)控PCH的發(fā)生，但其作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。
　　病理性心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜，我們首次應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析人hHole及Pygo1基因的基本理化性質(zhì)及基本結(jié)構(gòu)等，并在動(dòng)物整體水平驗(yàn)證了Hole及Pygo1在小鼠