樹突狀細胞與CRP在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的關系及機制研究.pdf

1、背景/意義: 冠心病（coronary heart disease，CHD）是目前威脅全人類健康和生命的主要疾病之一，由于其發(fā)病機制尚不明確，成為診斷和治療的重大障礙。針對其發(fā)病機制的研究，不僅一直是眾多學者研究的熱點，而且有利于降低CHD的發(fā)病率和死亡率。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CHD的病理改變基礎。AS的發(fā)病機制復雜，其發(fā)展過程主要經歷脂紋、脂斑、纖維斑塊、粥樣硬化斑塊等逐漸進展時期，具有緩慢進

2、展的特點，但AS的發(fā)病機制仍未十分明確。近年來，炎癥免疫反應在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關注，其理論的核心是：在動脈粥樣硬化的危險因素等抗原的刺激下，激活T淋巴細胞，引起的一系列特異性細胞免疫及體液免疫反應，進一步激活效應細胞，如巨噬細胞、血小板和平滑肌細胞，從而導致炎性產物的劇烈增加，促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和斑塊的破裂。 最近幾年研究發(fā)現，在體內具有最重要的抗原提呈和免疫應答調節(jié)的樹突狀細胞（dendritic c

3、ells，DCs）在動脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展中的作用受到廣泛關注。最近的研究提出，DCs在動脈粥樣硬化的早期和晚期都有數量和功能的改變，尤其是DCs可能與冠心病晚期急劇進展有關。C反應蛋白（C reaetive Protein，CRP）是當前備受關注的動脈粥樣硬化炎癥標志物之一，在預測AS導致的各種心腦血管事件中具有重要的價值。近年來，較多的體外研究證據表明CRP損傷血管平滑肌細胞，血管內皮細胞，在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著直

4、接／間接的作用，以CRP作為治療靶點已經成為研究的熱點。目前國內外關于CRP與DCs的關系尚未明確報道。針對國內外的研究現狀，本文提出以下問題：1．DCs的分型和功能與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有密切關系，但是與AS的斑塊穩(wěn)定性的關系，尚無明確報道。2．CRP在促進AS的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，但是，CRP與DCs是否存在密切關系，還需要進一步的流行病學調查。3．CRP是否是DCs功能發(fā)生改變的因素之一，CRP誘導DCs改變的可能機制是什

5、么？鑒于DCs和CRP在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要作用，本課題在以往研究的基礎上，首先采用臨床病例對照研究，利用流式細胞等技術對不同的冠心病患者的外周血樹突狀細胞的分型和功能進行檢測，利用血管內超聲檢測冠狀動脈斑塊的性質，試圖說明DCs與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定系的關系，以及利用多種分子生物學技術從細胞水平上探討CRP與DCs的關系及其相關機制。本課題的研究結果將為指導臨床上診斷不穩(wěn)定心絞痛提供了新的標志物，并且為明確CRP和DCs在動脈粥

6、樣硬化中的關系提供了可靠的實驗室資料，為闡明AS的發(fā)病機制提供了一條新的方向。 全文主要分2個部分來闡明。 方法和內容: 第一部分、不同冠心病患者外周血樹突狀細胞分型及功能檢測。 目的：本研究根據患者臨床情況、冠脈造影和血管內超聲（intravascular ultra-sound，IVUS）診斷冠心病和斑塊的穩(wěn)定性，研究不同類型和不同性質斑塊冠心病患者外周循環(huán)中DCs數量和功能的變化，探討DCs與冠脈粥

7、樣硬化斑塊從穩(wěn)定到到“易損”的關系，以期早期發(fā)現易損斑塊，指導臨床診治。 方法：入選病例總共80例，其中AMI組15例、UAP（CTNI+）組15例、UAP（CTNI-）組15例、SAP組17例、CTL18例，一般臨床資料的比較顯示：各組的年齡、性別比例相比差異無顯著性意義（P>0．05）。各組中主要的心血管病危險因素，如：吸煙（Smoking）、高血壓（Hypertension）、血糖（Diabetes mellitus）、總

8、膽固醇（Total cholesterol）、甘油三脂（Triglyceride）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL cholesterol）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL cholesterol）等，相互之間的比較差異無顯著性意義（p>0．05），將冠心病按穩(wěn)定心絞痛、肌鈣蛋白陰性不穩(wěn)定心絞痛（不存在著心肌壞死）、肌鈣蛋白陽性不穩(wěn)定心絞痛（心肌壞死標記物輕度升高，存在著少量心肌細胞壞死）、急性心肌梗死分型，能較好的反應冠脈粥樣斑塊從穩(wěn)定-炎癥

9、反應增強-斑塊破裂-微小血栓形成-大血栓形成-相關血管閉塞的病理生理過程，即斑塊從穩(wěn)定到易損的過程。SAP、UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）組各10例患者行IVUS檢查，根據IVUS表現分為破裂斑塊組（7例）、不穩(wěn)定斑塊組（12例）和穩(wěn)定斑塊組（11例）；流式細胞4色分析法檢測DCs亞型前提的比例；流式細胞儀、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等分子生物技術測定DCs功能。 結論： 1．冠心病不同階段，外周血DCs

10、數量和比例的改變不同。在斑塊從不穩(wěn)定到“易損”的進展中，數量、比例從經歷了正常-顯著升高-減少的過程。 2．本研究分組SAP-UAP（CTNI-）-UAP（CTNI+）可大致體現冠狀動脈斑塊從穩(wěn)定-炎癥反應增強-斑塊破裂的病理生理過程。 不穩(wěn)定斑塊組mDCss的占外周血白細胞比例及絕對數均比穩(wěn)定斑塊組顯著增多；破裂斑塊組患者的mDCs、pDCs比例及絕對數均顯著減少，mDC2s比例、數量無顯著變化。提示外周血DCs數量、

11、比例反應斑塊性質，DCs與斑塊的穩(wěn)定性有關。 3．在冠狀動脈斑塊的穩(wěn)定性改變過程中，DCsCD86表型不斷增高，刺激淋巴細胞增殖能力增強，炎癥因子INF-a、IL-12分泌增加。 4．不同階段冠心病患者PBMC源性DCsCD86表達、刺激淋巴細胞增殖能力與血漿hs-CRP和IL-6水平成正相關。 因此，冠心病患者外周血DCs數量、功能變化提現斑塊的穩(wěn)定性變化，在不存在造血功能異常的條件下，檢測冠心病外周血DCs數

12、量、比例及功能可以一定程度反應冠心病患者冠脈斑塊穩(wěn)定性，可用于指導冠心病的分型及判別斑塊性質。 第二部分、CRP對樹突狀細胞分化成熟及機制研究。 目的：CRP對DCs分化過程中功能的影響，從而探討DCs和CRP的關系以及相關機制。 方法：分離人外周血單個核細胞，在含重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF，100ng/ml）和重組人白細胞介素-4（rhIL-4，20ng/ml）的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；根據不同

13、的實驗目的進行分組，主要分成3個實驗目的。目的1：觀察不同濃度CRP對DC細胞功能的影響；分成3組：①對照組；②CRP組：分別在細胞培養(yǎng)基中分別加入濃度為0．6、2、6、20和60μg/mL的CRP；③LPS組：加入含（0．1 μg/mL）LPS的100μl，使終濃度為1 mg/L；目的2：觀察不同干預因素對DCs細胞功能的影響；主要分成①對照組；②CRP組：分別在細胞培養(yǎng)基中分別加入濃度為20和60μg/mL的CRP；③CRP+CD3

14、2組（20μg/mL）：預先加入含有CD3220μg/mL的PBS溶液100μl，6小時加入60μg/mL的CRP，共同孵育24小時。目的3：觀察不同濃度CRP和不同干預因素對DCs表達CCR7的影響。①對照組；②CRP組：分別在細胞培養(yǎng)基中分別加入濃度為20μg/mL和60μg/mL的CRP；③CRP+CD32組（μg/mL）：預先加入含有CD3220μg/mL的PBS溶液100μl，6小時加入60μg/mL的CRP，共同孵育24小時

15、。④預先加入抗CD32特異的抗體6小時，檢測DCs中CCR7的含量。主要采用流式細胞術檢測DCs中CD1a、CD83、CD86、HLA-DR、CCR7表型；以DCs為刺激細胞、刺激同種異體T淋巴細胞為反應細胞按比例混合后，以混合淋巴細胞反應強度觀察對DCs抗原遞呈和淋巴細胞增殖的影響；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清細胞因子濃度；RT-PCR和蛋白電泳分別檢測DCs中CCR7的表達。 結論：CRP具有促進人單核細胞來源的DC表型改變