miR-29a在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機制.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種全身性的、彌漫的慢性發(fā)展過程，是導(dǎo)致冠心病的主要病理基礎(chǔ)。大量研究發(fā)現(xiàn)，炎癥和代謝異常與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而其中脂質(zhì)代謝作為冠心病獨立的危險因素在動脈硬化發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用。動脈粥樣硬化的病理過程大概分為血管內(nèi)皮功能受損、血管內(nèi)膜增厚和斑塊形成三個階段。其中以血管平滑肌細(xì)胞增殖和脂質(zhì)沉積為主要特征的血管內(nèi)膜增厚階段是動脈硬化形成的主要環(huán)節(jié)，因此對于這部分的

2、研究一直是熱點問題。
　　 MicroRNA（miRNA）是一種由非編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄的小片段RNA，廣泛的參與細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育等生理病理過程。隨著對miRNA認(rèn)識的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)miRNA在心血管疾病中起到了極其重要的作用，不僅參與心血管疾病的發(fā)生過程，其表達(dá)變化還與疾病的診斷和預(yù)后密切相關(guān)。MicroRNA-29a(miR-29a)是新近發(fā)現(xiàn)的一個與細(xì)胞增殖緊密相關(guān)的小分子RNA家族，參與多種疾病，如肝纖維化，腫瘤的

3、發(fā)生發(fā)展過程等。本實驗將探討miR-29a在動脈粥樣硬化的發(fā)生、斑塊穩(wěn)定方面的作用及其分子機制。
　　 方法:
　　 1.動脈粥樣硬化動物模型的復(fù)制及分組
　　 本實驗動物分為五組，分別為C57BL/6J對照組(B6，n=3)、ApoE敲除小鼠正常飲食組(AD，n=3)、ApoE敲除小鼠高脂飲食組(AG，n=3)、ApoE敲除小鼠尾靜脈注射pAd-GFP病毒高脂飲食組(AP，n=3)、以及ApoE敲除小鼠尾靜脈注

4、射pAd-miR-29a病毒高脂飲食組(AM，n=3)。C57BL/6J及AD組，正常飲食。AG、AP、AM組，高脂飲食。AP組分別于高脂飲食第1、7、14天尾靜脈注射pAd-GFP病毒(1×109pfu)。AM組分別于高脂飲食第1、7、14天尾靜脈注射miR-29a病毒(1×109pfu)
　　 2.miR-29a轉(zhuǎn)染不影響動脈粥樣硬化小鼠的血脂水平
　　 與B6組和AD組小鼠相比，AG組、AP組和AM組（血脂各項指標(biāo)

5、比較除HDL以外均有顯著性差異，其中TC和LDL-C升高最為顯著，6周末升高了3到5倍。但三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，以上結(jié)果提示，血脂增高在AS斑塊形成過程中發(fā)揮了重要的作用，但轉(zhuǎn)染miR-29a對血脂水平無影響。
　　 3.miR-29a對脂質(zhì)斑塊形成的影響
　　 高分辨力超聲檢查:高脂飼養(yǎng)6周末B6組、AD組小鼠主動動脈弓內(nèi)膜光滑完整，連續(xù)，內(nèi)膜不厚，彩色充盈佳。ApoE敲除小鼠高脂飲食6周后，AG、AP和AM組小

6、鼠主動動脈弓內(nèi)膜漸粗糙不完整，回聲有間斷，內(nèi)膜增厚厚，彩色充盈尚可，可見低回聲脂質(zhì)斑塊。
　　 4.miR-29a轉(zhuǎn)染促進(jìn)斑塊組織中平滑肌細(xì)胞的增殖
　　 各組小鼠取胸腹主動脈，經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，B6組和AD組小鼠血管內(nèi)膜光滑，彈力層完整，中膜未變化;AG組、AP組、AM組均見內(nèi)膜增厚，有較大斑塊形成;AG組和AP組沒有明顯區(qū)別;AM組可見增殖內(nèi)膜中新增血管平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，提示，miR-29a轉(zhuǎn)染可能

7、通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖而促進(jìn)斑塊的形成。
　　 5miR-29a不影響斑塊組織中脂質(zhì)的沉積
　　 油紅O染色顯示飼喂高脂飼料各組老鼠斑塊的泡沫細(xì)胞內(nèi)含有大量聚集的脂肪呈鮮紅色。AG組、AP組和AM組均可以看到紅染脂質(zhì)浸潤、斑塊形成及血栓脫落;三組之間無明顯差異。提示，miR-29a轉(zhuǎn)染不影響斑塊組織的脂質(zhì)沉積。
　　 6.miR-29a促進(jìn)斑塊組織中膠原的合成
　　 天狼猩紅（膠原）與油紅O（脂質(zhì)）復(fù)合

8、染色可見，與B6組及AD組相比，AG組、AP組、AM組膠原合成明顯增多，其中以AM組增加最為明顯。上述結(jié)果提示miR-29a可以促進(jìn)斑塊組織內(nèi)膠原的合成。
　　 7.miR-29a不影響斑塊組織中巨噬細(xì)胞的侵潤
　　 我們用免疫組化檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80在各組斑塊中的表達(dá)與分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在B6組和AD組血管壁中，偶見F4/80陽性的細(xì)胞;而AG組、AP組和AM組中，F(xiàn)4/80陽性細(xì)胞數(shù)及單細(xì)胞染色強度均較B6組和

9、AD組明顯增高，而且主要分布在中膜層和新生內(nèi)膜層;AG組、AP組和AM組之間未見顯著差別。提示，動脈斑塊形成伴隨炎性細(xì)胞浸潤，而過表達(dá)miR-29a并不促進(jìn)巨噬細(xì)胞的聚集和侵潤。
　　 8.miR-29a促進(jìn)斑塊組織中平滑肌細(xì)胞的增殖
　　 免疫組化的方法檢測了各組斑塊內(nèi)PCNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，B6組和AD組血管壁中偶見PCNA陽性的細(xì)胞，AG、AP和AM組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)及單細(xì)胞染色強度均較B6組和AD組增高，且主

10、要分布在新生內(nèi)膜層，其中以AM組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)最多，為對照組的5倍，說明，miR-29a可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 9.miR-29a促進(jìn)斑塊組織中平滑肌細(xì)胞KLF5的表達(dá)
　　 為了進(jìn)一步明確miR-29a促進(jìn)斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞增殖的分子機制，我們用免疫組化和RT-PCR的方法，檢測了斑塊組織內(nèi)KLF5表達(dá)及其分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF5陽性的細(xì)胞在AM組較B6和AD組，增加了近5倍。提示，miR-29a促進(jìn)了斑塊

11、內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞的增殖的分子機制可能與上調(diào)增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子KLF5的表達(dá)有關(guān)。
　　 結(jié)果:
　　 1.動脈粥樣硬化動物模型的復(fù)制及分組。
　　 2.miR-29a轉(zhuǎn)染不影響動脈粥樣硬化小鼠的血脂水平。
　　 3.miR-29a對脂質(zhì)斑塊形成的影響。
　　 4.miR-29a轉(zhuǎn)染促進(jìn)斑塊組織中平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 5.miR-29a不影響斑塊組織中脂質(zhì)的沉積。
　　 6.miR

12、-29a促進(jìn)斑塊組織中膠原的合成。
　　 7.miR-29a不影響斑塊組織中巨噬細(xì)胞的侵潤。
　　 8.miR-29a促進(jìn)斑塊組織中平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 9.miR-29a促進(jìn)斑塊組織中平滑肌細(xì)胞KLF5的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.miR-29a轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 2.miR-29a轉(zhuǎn)染不影響斑塊組織的脂質(zhì)沉積和巨噬細(xì)胞浸潤。
　　 3.miR-2