經(jīng)重組抗原P29誘導(dǎo)的免疫保護(hù)下細(xì)粒棘球蚴感染宿主后長鏈非編碼RNA差異表達(dá)的篩選.pdf

1、目的：
　　為了研究長鏈非編碼RNA是否參與了宿主免疫細(xì)胞分化的過程，本課題利用重組疫苗P29對動物具有較好免疫保護(hù)力的作用，制備了疫苗免疫-病原體感染動物模型。在此基礎(chǔ)上研究在重組疫苗P29免疫誘導(dǎo)下及病原體感染后，長鏈非編碼RNA差異表達(dá)的情況，為解決寄生蟲病研究中存在的宿主與病原體間免疫相互作用及免疫逃逸等難題探索新的途徑。
　　方法：
　　1.純化和制備細(xì)粒棘球絳蟲重組疫苗P29。
　　2.疫苗免疫-病原

2、體感染動物模型的制備：將BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、P29免疫+感染組和未免疫感染組。用重組疫苗免疫P29免疫+感染組小鼠（免疫3次），與第三次免疫間隔三個月后用細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴感染小鼠（空白對照組不感染）。分別在第一次免疫前、第三次免疫后2周、感染病原體后2周，小鼠眼球取血制備外周血淋巴細(xì)胞。感染6個月后處死P29免疫+感染組和未免疫感染組小鼠，統(tǒng)計包囊數(shù)，計算出重組疫苗P29所引起的免疫保護(hù)力。
　　3.提取總RNA

3、：利用TRIZOL法提取各組小鼠各個時間點的外周血淋巴細(xì)胞中總RNA。
　　4.構(gòu)建lncRNA和mRNA序列文庫：用Epicentre公司的Magnetic Core試劑盒進(jìn)行l(wèi)ncRNA的分離及建庫，用KAPA公司的KAPA Strand mRNA-SeqKit進(jìn)行mRNA的分離及建庫。用2％瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化后，用Agilent2100檢驗文庫質(zhì)量。
　　5.高通量測序：構(gòu)建好的lncRNA和mRNA序列文庫用

4、Illumina公司HiSeq2000高通量測序儀進(jìn)行測序分析。
　　6.生物信息學(xué)方法對測序碎片進(jìn)行拼接：用tophat2軟件進(jìn)行拼接，將高質(zhì)量reads比對到小鼠基因組上，并構(gòu)建各組、各時間點的lncRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄本。
　　7.生物信息學(xué)方法篩選差異表達(dá)分子：用Cufflinks軟件對全部reads正態(tài)分布化，獲得可以相互比較的表達(dá)數(shù)據(jù)，用Cuffdiff軟件按照P value≤0.05且fold change≥2

5、標(biāo)準(zhǔn)對實驗組及對照組免疫后2周、感染病原體后2周的lncRNA及mRNA表達(dá)量進(jìn)行差異分析。
　　8.注釋：使用lncRNAdb數(shù)據(jù)庫（http://www.lncRNAdb.org/）、UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)注釋差異表達(dá)的lncRNA。
　　9.lncRNA與對應(yīng)mRNA的關(guān)聯(lián)性分析：通過計算實驗組及對照組各個時間點差異表達(dá)lncRNA及mRNA表達(dá)量的皮爾森系數(shù)（r），以r的絕對

6、值大于0.99為閾值，確定lncRNA與mRNA的相關(guān)關(guān)系。
　　10.對P29免疫+感染組及空白對照組免疫后差異表達(dá)lncRNA及相關(guān)mRNA分子進(jìn)行初步驗證：將BALB/c小鼠隨機分為空白組，免疫組，免疫組小鼠經(jīng)重組疫苗P29免疫3次，空白組不做處理，分別在第一次免疫前、第三次免疫后兩周眼球取血制備外周血淋巴細(xì)胞。TRIZOL法提取總RNA，構(gòu)建cDNA文庫。利用熒光定量PCR技術(shù)對差異表達(dá)的lncRNA及相關(guān)mRNA分子進(jìn)行

7、初步驗證。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建疫苗免疫-病原體感染動物模型，重組疫苗 P29免疫小鼠獲得了94.8%的免疫保護(hù)力。
　　2.成功提取總RNA，經(jīng)核酸蛋白微量分析儀測定各組總RNA OD260/OD280均在1.8-2.0之間，總量均超過5μg，滿足建庫要求。
　　3.成功構(gòu)建mRNA文庫及l(fā)ncRNA文庫，通過Agilent2100檢驗，符合測序要求。
　　4.mRNA文庫測序結(jié)果：P29免疫+感

8、染組免疫后mRNA文庫獲得19717433條reads，其中高質(zhì)量reads共12375673條，比對率為94.2％。P29免疫+感染組感染后mRNA文庫獲得24908555條reads，其中高質(zhì)量reads共14766919條，比對率為94.8％?？瞻讓φ战M免疫后mRNA文庫獲得25555287條reads，其中高質(zhì)量reads共15703026條，比對率為96.1％。空白對照組感染后mRNA文庫獲得23772436條reads，其中

9、高質(zhì)量reads共15251560條，比對率為96.3％。未免疫感染組感染后mRNA文庫獲得21539925條reads，其中高質(zhì)量reads共13748866條，比對率為95.1％。各文庫測序量均在4Gb以上。
　　5.lncRNA文庫測序結(jié)果：P29免疫+感染組免疫后lncRNA文庫獲得23367854條reads，其中高質(zhì)量reads共16756424條，比對率為85.1％。P29免疫+感染組感染后lncRNA文庫獲得218

10、03045條reads，其中高質(zhì)量reads共16449971條，比對率為87.6％?？瞻讓φ战M免疫后lncRNA文庫獲得25501392條reads，其中高質(zhì)量reads共18047705條，比對率為84.7％?？瞻讓φ战M感染后lncRNA文庫獲得21803045條reads，其中高質(zhì)量 reads共16449971條，比對率為87.6％。未免疫感染組感染后lncRNA文庫獲得18171176條reads，其中高質(zhì)量reads共125

11、21894條，比對率為95.1％。各文庫測序量均在4Gb以上。
　　6.篩選差異表達(dá)分子結(jié)果：P29免疫+感染組和空白對照組免疫后差異表達(dá)的lncRNA共17個，mRNA共473個。空白對照組與未免疫感染組感染后差異表達(dá)的lncRNA共14個，mRNA共85個。P29免疫+感染組和未免疫感染組感染后差異表達(dá)的lncRNA共30個，mRNA共192個。
　　7.lncRNA與對應(yīng)mRNA的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果：每個差異表達(dá)的lncR

12、NA與多個編碼蛋白基因顯著相關(guān)。
　　8.初步驗證結(jié)果：對P29免疫+感染組及空白對照組免疫后差異表達(dá)lncRNA及相關(guān)mRNA進(jìn)行qPCR驗證，其中l(wèi)ncRNA靶分子XLOC-012763與對應(yīng)mRNA Dab2ip、Hc、Trem、Oas3；INTE-015204與對應(yīng)mRNA klf4、Patz1、Cxcl2；INTE-028466與對應(yīng)mRNA Kler1、Jchain存在差異表達(dá)，與lncRNA與對應(yīng)mRNA關(guān)聯(lián)性分析結(jié)

13、果一致。
　　結(jié)論
　　1.獲得疫苗誘導(dǎo)下差異表達(dá)lncRNA共17個，mRNA共473個。獲得病原體感染下差異表達(dá)的 lncRNA共14個，mRNA共85個。獲得疫苗誘導(dǎo)病原體感染差異表達(dá)lncRNA共30個，mRNA共192個。
　　2.初步認(rèn)定lncRNA XLOC-012763與對應(yīng)mRNA Dab2ip、Hc、Trem、Oas3；INTE-015204與對應(yīng)mRNA klf4、Patz1、Cxcl2；INTE