抗原B誘導(dǎo)泡球蚴肝移植后免疫耐受的機(jī)制研究.pdf

1、針對(duì)泡球蚴肝移植中面臨的寄生蟲(chóng)感染免疫和移植免疫交織而凸現(xiàn)出來(lái)的臨床問(wèn)題，本課題嘗試觀察抗原B在誘導(dǎo)泡球蚴肝移植后免疫耐受中的作用和機(jī)制。首先對(duì)包蟲(chóng)病患者的體液免疫和細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行了研究，比較了包蟲(chóng)病患者血清IgG，IgA，IgM，IgE等抗體的水平及Th1，Th2細(xì)胞因子的水平與正常人群的區(qū)別；通過(guò)泡球蚴感染的大鼠肝移植模型，觀察了肝臟病理和細(xì)胞因子的變化；制備了人工重組抗原B，探討抗原B在包蟲(chóng)免疫逃避中的作用及誘導(dǎo)宿主免疫耐受形成

2、的機(jī)制；利用人工重組抗原B真核表達(dá)的單鏈可變區(qū)抗體，觀察了該抗體對(duì)原頭節(jié)的殺傷作用。目的是以抗原B及其特異性抗體為研究工具，觀察泡狀棘球蚴感染引起的宿主免疫耐受狀態(tài)對(duì)泡狀棘球蚴大鼠肝移植后移植肝存活的影響，細(xì)胞免疫，體液免疫狀態(tài)的變化特點(diǎn)及其與抗原B的關(guān)系，為今后使用抗原B治療靶點(diǎn)，誘導(dǎo)機(jī)體的自發(fā)耐受，用抗原B的特異性抗體阻斷復(fù)發(fā)或再感染，指導(dǎo)移植手術(shù)后免疫抑制劑使用方案奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料和方法首先對(duì)64例肝包蟲(chóng)病患者和58例

3、門(mén)診健康體檢人群進(jìn)行體液免疫和細(xì)胞免疫的檢測(cè)，測(cè)定內(nèi)容包括：血清總抗體和補(bǔ)體(IgA，IgG，IgM，IgE水平及C3，CRP)，人體包蟲(chóng)病特異性抗體(頭節(jié)，囊液，抗原B，EM2)，血清細(xì)胞因子(可溶性白介素2受體，血清白介素2，4，8，10和IFN-γ) 建立人工感染腹腔泡球蚴的動(dòng)物模型，分感染組，未感染組和對(duì)照組進(jìn)行肝臟移植，獲得生存時(shí)間等基本數(shù)據(jù)，觀察宿主對(duì)移植肝的免疫排斥情況，用熒光標(biāo)記的CD30抗體檢測(cè)T淋巴細(xì)胞在移植

4、肝中的分布。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，檢測(cè)移植排斥和耐受的受者中Th1和Th2細(xì)胞因子中的具有代表性的IFN-γ和IL-4的mRNA的表達(dá)水平，探討IFN-γ和IL-4mRNA表達(dá)與移植耐受的關(guān)系。 用高速離心法制備囊液天然抗原B，用親和層析法制備半純化的抗原B，用基因克隆的方法制備了人工重組的抗原B，人工重組的抗原B與包蟲(chóng)患者脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法來(lái)觀察代表TH1型的IFN-r和代表TH2型的IL4的表達(dá)

5、，用人工重組抗原B與人T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察抗原B與人T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)功能變化，DNA斷裂試驗(yàn)，彗星試驗(yàn)和TUNEL試驗(yàn)用來(lái)從不同時(shí)相檢測(cè)調(diào)亡，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)濃度變化，分析其作用機(jī)制。 在已經(jīng)得到人源化抗包蟲(chóng)病單鏈可變區(qū)抗體(SingleChainFragmentVariable，ScFv)的工作基礎(chǔ)上，采用真核表達(dá)，體外培養(yǎng)的方法，研究了該人源化抗體在體外抑制人體包蟲(chóng)囊腫原頭節(jié)生

6、長(zhǎng)的作用。 結(jié)果觀察的64例包蟲(chóng)病患者體液免疫特點(diǎn)為：血清總抗體水平IgA無(wú)顯著差異，而IgM，IgE水平均高于正常對(duì)照組(P均＜0.05)，而IgG的升高更為明顯(P＜0.01)，包蟲(chóng)病患者血清四種抗包蟲(chóng)病的特異性抗體顯著升高(P＜0.01)，血清補(bǔ)體和急性反應(yīng)蛋白的水平略高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，細(xì)胞因子變化的特點(diǎn)為：由Th1細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ和sIL-2R等細(xì)胞因子中，IL-2和sIL-2R顯著降低；Th2分泌的IL

7、-4、IL-8和IL-10中IL-4、IL-8顯著升高。包蟲(chóng)病患者的Th1和Th2平衡失調(diào)，處于免疫抑制狀態(tài)。 通過(guò)腹腔注射新鮮處理的原頭蚴組織制備大鼠繼發(fā)泡球蚴感染模型的技術(shù)路線可行，對(duì)照組、排斥組、泡球蚴感染90天組、泡球蚴感染50天組受者存活時(shí)間平均分別為35天以上，5.2天、8天和5天。感染泡球蚴較未感染組顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，泡狀棘球蚴感染后移植肝中Th2類的細(xì)胞因子IL-4在泡球蚴感染組呈現(xiàn)高表達(dá)，在排斥組中低

8、表達(dá)，而Th1類的細(xì)胞因子IFN則相反，說(shuō)明了泡球蚴干擾能造成Th1類細(xì)胞因子向Th2類偏移，這種“免疫偏離”有助于建立泡球蚴感染的移植免疫耐受，從而有利于同種異體移植物的存活，移植肝中T淋巴細(xì)胞顯著減少，提示寄生蟲(chóng)感染抑制了抗原特異性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，寄生蟲(chóng)抗原抑制了T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主對(duì)抗原特異性的無(wú)應(yīng)答反應(yīng)，從而誘導(dǎo)耐受。 制備的囊液粗抗原成分復(fù)雜，大分子量組分多，免疫反應(yīng)靈敏度高，交叉反應(yīng)嚴(yán)重，半純化抗原B去除了大分子物

9、質(zhì)，集中在12KD和20KD左右，有一定的交叉反應(yīng)，而人工重組抗原B組分單一，紫外掃描中顯示為光滑單一的210nm處的吸收峰，蛋白電泳和Western-blotting顯示抗原B為12KD蛋白。 包蟲(chóng)病人肝臟中抗原B的定位和免疫組化結(jié)果表明：包蟲(chóng)患者肝組織抗原B大量表達(dá)，陽(yáng)性顆粒定位于肝細(xì)胞胞漿，陽(yáng)性細(xì)胞呈散在分布，抗原B刺激包蟲(chóng)病人脾淋巴細(xì)胞后可引起IL-4分泌增高，IFN-γ分泌降低，Th1向Th2漂移，體外實(shí)驗(yàn)中抗原B作用

10、于淋巴細(xì)胞后引起人JurkatT淋巴細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)抗原特異性T淋巴細(xì)胞凋亡是抗原B作用下機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受的可能原因之一，抗原B誘導(dǎo)抗原特異性T淋巴細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)和可能的機(jī)制是通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。 抗棘球蚴抗原B的人源單鏈可變區(qū)抗體(ScFv)通過(guò)真核表達(dá)載體p-EGFP-N3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，使單鏈抗體獲得了高水平的表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析，該單鏈抗體具有與原頭節(jié)結(jié)合的特異性，體外培

11、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明人源化的ScFv對(duì)人體包蟲(chóng)原頭節(jié)有抑制作用，高劑量組(1mg/L)顯示出明顯的抑制作用，而中(0.1mg/L)、低(0.01mg/L)劑量組與對(duì)照組的原頭節(jié)死亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示效果與ScFv劑量有關(guān)，在高劑量ScFv組可以看到隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在第5～7天原頭節(jié)出現(xiàn)不同程度的皺縮、壞死、崩解等變化，提示ScFv的作用與時(shí)間有關(guān)，抗棘球蚴抗原B的人源單鏈可變區(qū)抗體是一個(gè)研究包蟲(chóng)免疫機(jī)制的分子工具，具有人源化特點(diǎn)，有希望成為