腺相關(guān)病毒耳蝸局部基因轉(zhuǎn)染.pdf

1、第一部分不同徑路重組腺相關(guān)病毒在耳蝸細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率
　　目的:使用重組腺相關(guān)病毒作為基因轉(zhuǎn)染載體，分別通過(guò)耳蝸鼓階切開(kāi)途徑、膠原酶處理后經(jīng)圓窗膜徑路、耳蝸中階切開(kāi)途徑將病毒投放到內(nèi)耳，比較不同徑路的可靠性及安全性，為內(nèi)耳功能性基因轉(zhuǎn)染提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。
　　方法:選取經(jīng)閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試正常的Dunkin-Hartley豚鼠18只。按照不同的耳蝸給藥途徑分為三組:耳蝸鼓階切開(kāi)途徑（A組）、膠原酶處理后經(jīng)圓窗膜徑路組（B組

2、）、耳蝸中階切開(kāi)途徑（C組）。每組6只動(dòng)物，隨機(jī)選擇單側(cè)耳注射攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒(AAV-GFP，滴度3E^12PFU/mL)，對(duì)側(cè)耳采用相同的方法注射生理鹽水。術(shù)后兩周測(cè)試雙耳聽(tīng)性腦干反應(yīng)，處死動(dòng)物，并取出雙側(cè)耳蝸基底膜。采用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行染色，計(jì)算手術(shù)側(cè)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及毛細(xì)胞損失情況，并觀察對(duì)側(cè)毛細(xì)胞是否存在損傷及轉(zhuǎn)染情況。
　　結(jié)果:A組及B組的豚鼠術(shù)后兩周閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)顯示左右耳閾值與術(shù)前無(wú)明顯差

3、別。轉(zhuǎn)染表達(dá)產(chǎn)物的熒光信號(hào)主要分布在內(nèi)毛細(xì)胞，A組豚鼠在內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率是34％，外毛細(xì)胞3.6％;B組豚鼠內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為26％，外毛細(xì)胞1.2％;A組豚鼠內(nèi)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率略高于B組。C組豚鼠，術(shù)后閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)出現(xiàn)較明顯閾移，以4kHz最為明顯，內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率25％，外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率3.7％?？梢?jiàn)外毛細(xì)胞損傷，且以第二回最為明顯。三組動(dòng)物均未見(jiàn)對(duì)側(cè)耳蝸毛細(xì)胞損傷及轉(zhuǎn)染。
　　結(jié)論:經(jīng)耳蝸鼓階切開(kāi)途徑、膠原酶處理后經(jīng)

4、圓窗膜徑路、耳蝸中階切開(kāi)途徑均可將病毒注射到內(nèi)耳，并成功轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞。但是，在內(nèi)外毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率偏低。耳蝸中階切開(kāi)途徑可造成聽(tīng)功能的損傷及毛細(xì)胞的損失，因此，在耳蝸局部基因轉(zhuǎn)染中的作用有限。
　　第二部分重組腺相關(guān)病毒滴度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
　　目的:比較不同滴度的表面酪氨酸殘基敲除的重組腺相關(guān)病毒載體在耳蝸毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
　　方法:選取經(jīng)閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試正常的Dunkin-Hartley豚鼠24只，按照

5、使用病毒的情況不同隨機(jī)分為三組:A組:投放重組腺相關(guān)病毒(AAV-GFP，滴度4E^12PFU/mL);B組:投放表面酪氨酸殘基敲除的重組腺相關(guān)病毒(mutant-AAV-GFP，滴度3E^12PFU/mL);C組:投放高滴度變異腺相關(guān)病毒(mutant-AAV-GFP，滴度7E^13PFU/mL)。多有動(dòng)物均經(jīng)耳蝸鼓階切開(kāi)途徑投放病毒。每只動(dòng)物單側(cè)耳投放病毒5μL。手術(shù)后兩周測(cè)試雙耳閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)，處死動(dòng)物后取雙側(cè)耳蝸基底膜，采

6、用免疫熒光技術(shù)染色計(jì)算手術(shù)側(cè)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及毛細(xì)胞損失情況，并觀察對(duì)側(cè)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。
　　結(jié)果:術(shù)后兩周閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)顯示，左右耳閾值與術(shù)前無(wú)明顯差別。三組豚鼠的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率存在顯著差異。其中，C組豚鼠的內(nèi)、外毛細(xì)胞顯示出很高的轉(zhuǎn)染效率，內(nèi)毛細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率為82％，外毛細(xì)胞為46％，部分動(dòng)物的球囊毛細(xì)胞也可見(jiàn)轉(zhuǎn)染;B組豚鼠的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率稍低，內(nèi)毛細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率為44％，外毛細(xì)胞為8％;而A組豚鼠的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最

7、低，轉(zhuǎn)染的毛細(xì)胞主要集中在底回，而頂回幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)染。內(nèi)毛細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率33％，外毛細(xì)胞3％。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未見(jiàn)明顯毛細(xì)胞損傷;對(duì)側(cè)耳毛細(xì)胞未見(jiàn)轉(zhuǎn)染信號(hào)。
　　結(jié)論:高滴度的變異腺相關(guān)病毒在耳蝸毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染中具有極大的優(yōu)勢(shì)。病毒滴度的提高及病毒表面酪氨酸殘基的敲除提高了其在毛細(xì)胞中，特別是外毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。且該病毒對(duì)聽(tīng)功能及毛細(xì)胞無(wú)明顯損害，是目前基因轉(zhuǎn)染優(yōu)先選擇的載體。
　　第三部分腺相關(guān)病毒在新生小鼠耳蝸中的轉(zhuǎn)染

8、　　目的:使用變異的腺相關(guān)病毒在新生小鼠的耳蝸進(jìn)行轉(zhuǎn)染，探索使用基因轉(zhuǎn)染來(lái)治療遺傳性聾的可行性。
　　方法:選用C57BL-6J小鼠（出生后7天）48只，分別使用經(jīng)圓窗膜穿刺和膠原酶處理圓窗膜后滲透兩種方式進(jìn)行腺相關(guān)病毒耳蝸基因轉(zhuǎn)染。在膠原酶處理組中，分別使用不同濃度的膠原酶30mg/mL，60mg/mL，90mg/mL。比較經(jīng)圓窗膜穿刺和膠原酶處理圓窗膜后滲透兩種方式的聽(tīng)功能損傷情況及耳蝸細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。
　　結(jié)果:90m

9、g/mL膠原酶處理新生小鼠圓窗膜后，可導(dǎo)致明顯的聽(tīng)功能損傷。使用30mg/mL膠原酶處理圓窗膜后，盡管沒(méi)有聽(tīng)功能損傷，但是經(jīng)該途徑的腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染不成功。使用60mg/mL膠原酶處理圓窗膜后，沒(méi)有聽(tīng)功能損傷，可在內(nèi)外毛細(xì)胞(IHC:47％，OHC:17％)及其他耳蝸細(xì)胞中可以看到轉(zhuǎn)染信號(hào)。經(jīng)圓窗膜穿刺途徑注射病毒，也沒(méi)有觀察到明顯的聽(tīng)功能損失，在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞(IHC:58％，OHC:19％)及其他耳蝸細(xì)胞中也可看到轉(zhuǎn)染。
　　結(jié)

10、論:通過(guò)經(jīng)圓窗膜穿刺途徑和60mg/mL膠原酶處理圓窗膜后滲透途徑，成功地實(shí)現(xiàn)了在新生小鼠耳蝸的局部基因轉(zhuǎn)染，為使用基因轉(zhuǎn)染治療遺傳性聾奠定了基礎(chǔ)。
　　第四部分重組腺相關(guān)病毒攜帶X連鎖凋亡抑制蛋白基因?qū)鬼樸K的耳毒性
　?。ㄒ唬┧倌?順鉑聯(lián)合作用建立耳毒性模型
　　目的:探討使用速尿-順鉑聯(lián)合作用建立耳毒性模型，并與順鉑連續(xù)注射比較聽(tīng)功能、毛細(xì)胞損失的程度以及動(dòng)物的死亡率
　　方法:選取健康豚鼠48只，并進(jìn)行開(kāi)

11、放聲場(chǎng)ABR測(cè)試。按照注射順鉑的劑量不同豚鼠隨機(jī)分為四組:A組，200mg/kg速尿注射后，給予0.1mg/kg順鉑;B組，200mg/kg速尿注射后，給予0.2mg/kg順鉑;C組，200mg/kg速尿注射后，給予2mg/kg順鉑;D組，3mg/kg順鉑連續(xù)注射5天。耳毒性藥物完成注射后一周，再次測(cè)試動(dòng)物的開(kāi)放聲場(chǎng)ABR，并處死動(dòng)物，使用熒光染色技術(shù)觀察毛細(xì)胞的損傷情況。
　　結(jié)果:速尿-順鉑聯(lián)合作用可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的聽(tīng)功

12、能損傷。200mg/kg速尿與0.1mg/kg、0.2mg/kg、2mg/kg的順鉑聯(lián)合使用分別造成了11.6％、45.6％、97.7％的外毛細(xì)胞損傷。順鉑連續(xù)注射所造成的動(dòng)物死亡率為45％，而使用速尿-順鉑聯(lián)合作用造成的動(dòng)物死亡率為14％。后者明顯低于前者。
　　結(jié)論:速尿-順鉑聯(lián)合作用能夠高效地造成聽(tīng)功能及外毛細(xì)胞損失，這種耳毒性模型的動(dòng)物死亡率大大地低于順鉑連續(xù)注射造成的動(dòng)物死亡率。
　　（二）經(jīng)圓窗膜途徑注射順鉑建立

13、耳毒性模型
　　目的:探討使用經(jīng)圓窗膜注射順鉑建立耳毒性模型，評(píng)估這種耳毒性模型的聽(tīng)功能、毛細(xì)胞損失的程度以及動(dòng)物的死亡率
　　方法:選取健康豚鼠24只，并進(jìn)行雙耳閉合聲場(chǎng)ABR測(cè)試。按照注射順鉑的劑量不同豚鼠隨機(jī)分為三組:A組，0.125mg/mL順鉑5μL;B組，0.25mg/mL順鉑5μL;C組，0.5mg/mL順鉑5μL。耳毒性藥物完成注射后一周，再次測(cè)試動(dòng)物的閉合聲場(chǎng)聲場(chǎng)ABR，并處死動(dòng)物，使用熒光染色技術(shù)觀察毛細(xì)

14、胞的損傷情況。
　　結(jié)果:經(jīng)圓窗膜注射順鉑可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的聽(tīng)功能損傷。0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL順鉑5μL經(jīng)圓窗膜注射分別造成了0.1％、13％、60％的外毛細(xì)胞損傷。該耳毒性模型的動(dòng)物死亡率為10％。
　　結(jié)論:經(jīng)圓窗膜注射順鉑能夠高效地造成聽(tīng)功能及外毛細(xì)胞損失，這種耳毒性模型的動(dòng)物死亡率大大地低于順鉑連續(xù)注射造成的動(dòng)物死亡率。
　?。ㄈ┲亟M腺相關(guān)病毒攜帶X連鎖凋亡抑制蛋白基

15、因?qū)鬼樸K的耳毒性
　　目的:探討使用重組腺相關(guān)病毒作為基因載體，攜帶X連鎖凋亡抑制蛋白基因(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein，XIAP)進(jìn)行耳蝸局部基因轉(zhuǎn)染來(lái)對(duì)抗順鉑介導(dǎo)的毛細(xì)胞死亡的可行性。
　　方法;選取健康豚鼠36只，將mutant-AAV-XIAP(滴度4E^13PFU/mL)經(jīng)耳蝸鼓階切開(kāi)途徑投放到成年豚鼠的任意一側(cè)耳蝸，對(duì)側(cè)為對(duì)照耳，注射生理鹽水，所有試驗(yàn)動(dòng)物于手術(shù)后兩周分

16、別測(cè)試雙耳閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)，然后給予速尿-順鉑聯(lián)合注射，破壞外毛細(xì)胞。分別于耳毒性藥物注射后12小時(shí)、3天及7天，測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙耳閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)。聽(tīng)力學(xué)測(cè)試完成后處死動(dòng)物，行基底膜鋪片，使用熒光染色技術(shù)觀察毛細(xì)胞的損傷及局部凋亡產(chǎn)物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:術(shù)后兩周，豚鼠雙耳的閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值無(wú)明顯差異。在耳毒性藥物注射后12小時(shí)、3天及7天，雙耳閉合聲場(chǎng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)的閾值均上升，雙耳在各頻率的閾移沒(méi)有明顯差異。在

17、耳毒性藥物注射后12小時(shí)，即可觀察到外毛細(xì)胞損傷及凋亡產(chǎn)物，雙耳的外毛細(xì)胞損失量有明顯差異，注射病毒側(cè)耳蝸基底膜中的凋亡產(chǎn)物信號(hào)明顯少于注射生理鹽水側(cè)耳蝸的基底膜中的熒光信號(hào)。在耳毒性藥物注射后3天，雙側(cè)耳蝸基底膜上凋亡產(chǎn)物的量及外毛細(xì)胞損失量無(wú)明顯差異。耳毒性藥物注射后7天后，雙側(cè)耳蝸外毛細(xì)胞損失沒(méi)有明顯差別。
　　結(jié)論:通過(guò)耳蝸局部投放重組腺相關(guān)病毒搭載X連鎖凋亡抑制蛋白基因，能夠在順鉑損傷耳蝸外毛細(xì)胞的早期發(fā)揮作用，通過(guò)抑制