重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的CD151基因轉(zhuǎn)染促血運(yùn)重建的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 血管再生性治療已成為當(dāng)前冠心病治療基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。如能在心肌缺血發(fā)生后的恰當(dāng)時(shí)間內(nèi)使血管再生，形成或開放冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)，就可以挽救頓抑心肌，減輕心肌缺血，減少心肌細(xì)胞的死亡數(shù)量，從而保護(hù)心臟功能，改善病人的臨床癥狀和預(yù)后。
　　 四跨膜蛋白超家族（transmembrane-4 superfamily，TM4SF）成員CD151能與多種整合素亞型特異性結(jié)合形成CD151-整合素復(fù)合體，是整

2、合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜連接器，也是多種整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)。隨著整合素與血管生成方面研究的不斷深入，CD151也日益受到關(guān)注。研究證實(shí)CD151參與調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、黏附、遷移、半橋粒結(jié)構(gòu)的形成，及與整合素相互作用介導(dǎo)血管生成等。
　　 前期研究中，我們將攜帶CD151基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染大鼠后肢缺血模型，發(fā)現(xiàn)后肢微血管密度及運(yùn)動(dòng)耐力明顯高于未轉(zhuǎn)染CD151組，初步確定了CD151在體內(nèi)促血管生成的作用；進(jìn)一

3、步的實(shí)驗(yàn)中，利用裸質(zhì)粒注射的方法在心肌梗死模型大鼠心肌中轉(zhuǎn)染CD151，發(fā)現(xiàn)CD151可明顯促進(jìn)梗死后心肌中微血管的生成。這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明增強(qiáng)CD151的表達(dá)能夠促進(jìn)缺血組織的血管生成。但新的研究提示僅促進(jìn)微血管形成并不能改善血流灌注，血液的流通更傾向于依靠動(dòng)脈血管而不是微血管。那么，通過增強(qiáng)CD151的表達(dá)促進(jìn)缺血組織的血管生成，是否能夠促進(jìn)有效的血運(yùn)重建并改善缺血組織器官功能以及其促血管生成的機(jī)制如何，均還需進(jìn)一步研究。我們?cè)O(shè)

4、計(jì)本課題是建立在CD151的研究成果上，觀察CD151促血管生成的有效性，即是否促進(jìn)了功能性的血運(yùn)重建，并進(jìn)一步探討其促血管生成的機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.構(gòu)建pAAV-CD151、pAAV-antiCD151重組質(zhì)粒及pAAV-GFP對(duì)照質(zhì)粒。質(zhì)粒擴(kuò)增、提取，氯化銫梯度離心法純化質(zhì)粒。采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法包裝CD151、antiCD151和GFP重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associa

5、ted virus，rAAV）。
　　 2.1月齡小型豬22頭，隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組4頭（不予冠脈結(jié)扎和注射病毒，正常喂養(yǎng)），rAAV-GFP組6頭（結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌內(nèi)分10點(diǎn)注射1×1012 viron particles的rAAV-GFP病毒），rAAV-CD151組6頭（結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌內(nèi)分10點(diǎn)注射1×1012 viron particles的rAAV-CD151病毒），rAAV-antiC

6、D151組6頭（結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌內(nèi)分10點(diǎn)注射1×1012 viron particles的rAAV-antiCD151病毒）。轉(zhuǎn)染8周后，RT-PCR、Western blot免疫印跡和免疫組化法檢測(cè)心肌中CD151的蛋白表達(dá)及mRNA水平，免疫組化法檢測(cè)微血管密度和小動(dòng)脈密度，左冠狀脈造影評(píng)價(jià)側(cè)支循環(huán)的建立，13N-NH3 PET 顯像評(píng)價(jià)心肌灌注，超聲心動(dòng)圖進(jìn)行小型豬心臟射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）及室壁厚度的測(cè)

7、定，評(píng)價(jià)心功能。此外，Western blot檢測(cè)FAK、PI3K、Akt、eNOS、ERK、p38MAPK等信號(hào)通路蛋白表達(dá)，亞硝酸還原酶法測(cè)定心肌組織NO含量。
　　 3.將構(gòu)建含有正反義CD151基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力，Boyden小室法測(cè)定細(xì)胞的遷移能力，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞種植在Matrigel上，觀察其類微血管結(jié)構(gòu)的形成情況。Western blot檢測(cè)CD151及ERK、p38

8、MAPK的蛋白表達(dá)。同時(shí)，進(jìn)一步觀察ERK、p38MAPK信號(hào)抑制劑對(duì)CD151誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、類微血管形成的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.成功建立了小型豬心肌梗死模型。病毒轉(zhuǎn)染8周后，心肌組織CD151 mRNA水平及蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和rAAV-GFP組（P<0.05）；rAAV-CD151組微血管密度和小動(dòng)脈密度均顯著高于正常對(duì)照組和rAAV-GFP組（P<0.05）。rAAV-antiCD151

9、組CD151mRNA水平及蛋白表達(dá)則降低，微血管密度和小動(dòng)脈密度均減少（P<0.05）。冠脈造影顯示rAAV-GFP組有少量的側(cè)支血管形成，rAAV-CD151組側(cè)支血管水平不一，0～3 級(jí)都有，而rAAV-antiCD151組幾乎無(wú)側(cè)支血管形成。13N-NH3 PET心肌灌注顯示，與rAAV-GFP組相比，rAAV-CD151組血流灌注顯著改善，缺損面積明顯減少（P<0.05），而rAAV-antiCD151組缺血更嚴(yán)重、缺損面積顯著

10、變大（P<0.05）。超聲心動(dòng)圖顯示，rAAV-CD151組各項(xiàng)心功能參數(shù)（LVEF%、LVFS%、△ALWT和△IVST）、室壁厚度（ALWTd、IVSTd）均較rAAV-GFP組明顯增高（P<0.05），而rAAV-antiCD151組小型豬心功能參數(shù)和室壁厚度顯著低于rAAV-CD151組（P<0.05）。此外，Western blot結(jié)果顯示，高表達(dá)的CD151促進(jìn)磷酸化FAK、PI3K、磷酸化Akt、磷酸化eNOS、磷酸化ER

11、K的蛋白表達(dá)，心肌組織NO含量也明顯增加。
　　 2.高表達(dá)的CD151能夠促進(jìn)ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)形成，高表達(dá)的CD151能夠上調(diào)磷酸化ERK的表達(dá)，對(duì)磷酸化p38MAPK的蛋白表達(dá)影響則不大。ERK抑制劑（PD098059）能顯著減弱CD151誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)的形成，但p38 MAPK抑制劑（SB203580）則對(duì)CD151誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)

12、的形成無(wú)顯著影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1.高表達(dá)的CD151能促進(jìn)缺血心肌微血管和小動(dòng)脈的生成、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立、增加缺血心肌的血流灌注、明顯改善心功能。
　　 2.高表達(dá)的CD151能促進(jìn)FAK、PI3K/Akt/eNOS通路、ERK通路的激活。其促血管生成的機(jī)制可能與上述通路的激活有關(guān)。
　　 3.高表達(dá)的CD151能夠促進(jìn)ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)形成。其作用與ERK通路的激