重組腺相關病毒介導的CD151基因轉染促血運重建的作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 血管再生性治療已成為當前冠心病治療基礎和臨床研究的熱點。如能在心肌缺血發(fā)生后的恰當時間內使血管再生，形成或開放冠狀動脈側支循環(huán)，就可以挽救頓抑心肌，減輕心肌缺血，減少心肌細胞的死亡數(shù)量，從而保護心臟功能，改善病人的臨床癥狀和預后。
　　 四跨膜蛋白超家族（transmembrane-4 superfamily，TM4SF）成員CD151能與多種整合素亞型特異性結合形成CD151-整合素復合體，是整

2、合素信號轉導的跨膜連接器，也是多種整合素信號轉導的交匯點。隨著整合素與血管生成方面研究的不斷深入，CD151也日益受到關注。研究證實CD151參與調節(jié)細胞多種功能，包括調節(jié)細胞形態(tài)、黏附、遷移、半橋粒結構的形成，及與整合素相互作用介導血管生成等。
　　 前期研究中，我們將攜帶CD151基因的重組腺相關病毒轉染大鼠后肢缺血模型，發(fā)現(xiàn)后肢微血管密度及運動耐力明顯高于未轉染CD151組，初步確定了CD151在體內促血管生成的作用；進一

3、步的實驗中，利用裸質粒注射的方法在心肌梗死模型大鼠心肌中轉染CD151，發(fā)現(xiàn)CD151可明顯促進梗死后心肌中微血管的生成。這一系列的實驗結果表明增強CD151的表達能夠促進缺血組織的血管生成。但新的研究提示僅促進微血管形成并不能改善血流灌注，血液的流通更傾向于依靠動脈血管而不是微血管。那么，通過增強CD151的表達促進缺血組織的血管生成，是否能夠促進有效的血運重建并改善缺血組織器官功能以及其促血管生成的機制如何，均還需進一步研究。我們設

4、計本課題是建立在CD151的研究成果上，觀察CD151促血管生成的有效性，即是否促進了功能性的血運重建，并進一步探討其促血管生成的機制。
　　 研究方法：
　　 1.構建pAAV-CD151、pAAV-antiCD151重組質粒及pAAV-GFP對照質粒。質粒擴增、提取，氯化銫梯度離心法純化質粒。采用三質粒共轉染法包裝CD151、antiCD151和GFP重組腺相關病毒（recombinant adeno-associa

5、ted virus，rAAV）。
　　 2.1月齡小型豬22頭，隨機分為4組，分別為正常對照組4頭（不予冠脈結扎和注射病毒，正常喂養(yǎng)），rAAV-GFP組6頭（結扎冠狀動脈左前降支，心肌內分10點注射1×1012 viron particles的rAAV-GFP病毒），rAAV-CD151組6頭（結扎冠狀動脈左前降支，心肌內分10點注射1×1012 viron particles的rAAV-CD151病毒），rAAV-antiC

6、D151組6頭（結扎冠狀動脈左前降支，心肌內分10點注射1×1012 viron particles的rAAV-antiCD151病毒）。轉染8周后，RT-PCR、Western blot免疫印跡和免疫組化法檢測心肌中CD151的蛋白表達及mRNA水平，免疫組化法檢測微血管密度和小動脈密度，左冠狀脈造影評價側支循環(huán)的建立，13N-NH3 PET 顯像評價心肌灌注，超聲心動圖進行小型豬心臟射血分數(shù)（EF）、短軸縮短率（FS）及室壁厚度的測

7、定，評價心功能。此外，Western blot檢測FAK、PI3K、Akt、eNOS、ERK、p38MAPK等信號通路蛋白表達，亞硝酸還原酶法測定心肌組織NO含量。
　　 3.將構建含有正反義CD151基因的重組腺相關病毒轉染ECV304細胞，MTT法測定細胞增殖能力，Boyden小室法測定細胞的遷移能力，將轉染后的細胞種植在Matrigel上，觀察其類微血管結構的形成情況。Western blot檢測CD151及ERK、p38

8、MAPK的蛋白表達。同時，進一步觀察ERK、p38MAPK信號抑制劑對CD151誘導細胞增殖、遷移、類微血管形成的影響。
　　 實驗結果：
　　 1.成功建立了小型豬心肌梗死模型。病毒轉染8周后，心肌組織CD151 mRNA水平及蛋白表達明顯高于正常對照組和rAAV-GFP組（P<0.05）；rAAV-CD151組微血管密度和小動脈密度均顯著高于正常對照組和rAAV-GFP組（P<0.05）。rAAV-antiCD151

9、組CD151mRNA水平及蛋白表達則降低，微血管密度和小動脈密度均減少（P<0.05）。冠脈造影顯示rAAV-GFP組有少量的側支血管形成，rAAV-CD151組側支血管水平不一，0～3 級都有，而rAAV-antiCD151組幾乎無側支血管形成。13N-NH3 PET心肌灌注顯示，與rAAV-GFP組相比，rAAV-CD151組血流灌注顯著改善，缺損面積明顯減少（P<0.05），而rAAV-antiCD151組缺血更嚴重、缺損面積顯著

10、變大（P<0.05）。超聲心動圖顯示，rAAV-CD151組各項心功能參數(shù)（LVEF%、LVFS%、△ALWT和△IVST）、室壁厚度（ALWTd、IVSTd）均較rAAV-GFP組明顯增高（P<0.05），而rAAV-antiCD151組小型豬心功能參數(shù)和室壁厚度顯著低于rAAV-CD151組（P<0.05）。此外，Western blot結果顯示，高表達的CD151促進磷酸化FAK、PI3K、磷酸化Akt、磷酸化eNOS、磷酸化ER

11、K的蛋白表達，心肌組織NO含量也明顯增加。
　　 2.高表達的CD151能夠促進ECV304細胞的增殖、遷移和類微血管結構形成，高表達的CD151能夠上調磷酸化ERK的表達，對磷酸化p38MAPK的蛋白表達影響則不大。ERK抑制劑（PD098059）能顯著減弱CD151誘導的ECV304細胞的增殖、遷移和類微血管結構的形成，但p38 MAPK抑制劑（SB203580）則對CD151誘導的ECV304細胞的增殖、遷移和類微血管結構

12、的形成無顯著影響。
　　 實驗結論：
　　 1.高表達的CD151能促進缺血心肌微血管和小動脈的生成、促進側支循環(huán)的建立、增加缺血心肌的血流灌注、明顯改善心功能。
　　 2.高表達的CD151能促進FAK、PI3K/Akt/eNOS通路、ERK通路的激活。其促血管生成的機制可能與上述通路的激活有關。
　　 3.高表達的CD151能夠促進ECV304細胞的增殖、遷移和類微血管結構形成。其作用與ERK通路的激