嗜熱厭氧菌中木糖苷酶的定向改造.pdf

1、本研究以來源于Thermoanaerobacterium sp．strain JW/SL YS485中的木糖苷酶基因xylC為研究對(duì)象，將其從pxylo-2.2亞克隆至高效熱激表達(dá)載體pHsh(由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)上，得到質(zhì)粒pHsh-xylC，并通過基因定點(diǎn)突變的方式實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的高效表達(dá)，為其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。 本文結(jié)合DNA分析軟件，分別通過以下5次突變：優(yōu)化木糖苷酶基因xyICATG附近TIR區(qū)的mRNA二級(jí)

2、結(jié)構(gòu)使ATG從發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)中釋放出來，進(jìn)一步優(yōu)化其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)使RBS也從發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)中釋放出來，將緊接ATG后的第二密碼子由原來的GAA改成AAA，將基因N端翻譯起始區(qū)后的一段稀有密碼子較集中的區(qū)域的稀有密碼子改成大腸桿菌偏好性密碼子，及在ATG下游第十五個(gè)堿基后面加上DB序列等，得到一系列的突變質(zhì)粒pHsh-xyl Ⅰ、pHsh-xyl Ⅱ、pHsh-xyVlⅢ、pHsh-xylⅣ、pHsh-xyⅣ并將它們分別轉(zhuǎn)

3、入大腸桿菌JM109中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。重組菌pHsh-xyIC、pHsh-xyl Ⅰ、pHsh-xyl Ⅱ、pHsh-xylⅢ、pHsh-xylⅣ、pHsh-xylV每毫升菌液最高酶活分別達(dá)到1.35 U/ml、4.5 U/ml、3.012 U/ml、5.5 U/ml、5.49 U/ml、5.01 8 U/ml。重組菌pHsh-xylC的酶活是最初的重組菌pxylo-2.2的13.5倍。若以最初的重組菌pxylo-2.2和重組菌pHsh-

4、xylC為參照，重組菌pHsh-xylⅢ的酶活是重組菌pxylo-2.2的55倍，是重組菌pHsh-xylC的4.07倍。SDS-PAGE密度掃描結(jié)果顯示重組菌pHsh-xylⅢ的木糖苷酶表達(dá)量占總可溶性蛋白表達(dá)量的34％。這一結(jié)果顯示ATG附近的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及緊接ATG后的第二密碼子的改變對(duì)基因表達(dá)的影響很大。 通過熱處理、DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析、TOYOPEARLHW-55F分子篩

5、層析及Butyl-HIC疏水層析等步驟對(duì)重組酶進(jìn)行了提純。純化的木糖苷酶在SDS-PAGE膠上為單一電泳條帶，從氨基酸序列所推測(cè)的蛋白分子量大小為72.6 kDa,這與SDS-PAGE膠上反映的分子量大小相吻合。所得純酶的比酶活為62.9 U/mg蛋白，酶的純化倍數(shù)為3.6倍，得率是21.6％。純化結(jié)果顯示可以用熱處理的方式去除大量雜蛋白，使蛋白達(dá)到比較純，且酶活收率達(dá)到95％，這一結(jié)果表明在今后的工業(yè)化應(yīng)用過程中可以用熱處理這種低成本

6、而簡(jiǎn)便的方式制備該酶。另外，我們對(duì)重組木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明重組木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)與天然酶相似。重組酶只對(duì)pNPX有專一活性，其K<,m>值為28.4mM，K<,max>為275.8 U/mg。該酶對(duì)產(chǎn)物木糖有很高的耐受力，67 mM的D-木糖對(duì)酶活無影響，當(dāng)木糖濃度高達(dá)200mM時(shí)仍有70％的酶活殘留。酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，最適反應(yīng)pH值為6.0。在pH6.0，65℃條件下保溫2h后殘留酶活仍有87％。在pH 5.