嗜熱β-葡萄糖苷酶重組表達(dá)及纖維二糖水解特征研究.pdf

1、生物質(zhì)能源作為新型的可再生能源，其發(fā)展對(duì)于緩解化石能源枯竭危機(jī)、減少日益嚴(yán)重的環(huán)境污染具有極其重要的意義。將纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇等其他能源產(chǎn)品是生物質(zhì)能源發(fā)展的一個(gè)重要研究方向。但是，木質(zhì)纖維素的高效轉(zhuǎn)化利用仍然面臨著很多挑戰(zhàn)，其中一個(gè)重要問題是生物轉(zhuǎn)化過程中所需纖維素酶的生產(chǎn)成本太高。通過基因工程手段，獲得性能較佳的產(chǎn)業(yè)化纖維素酶可以顯著降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。我們知道，β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系的限速酶，它決定著纖維素酶整體活

2、力的高低;與溫和型β-葡萄糖苷酶相比，嗜熱型在工業(yè)應(yīng)用中具有明顯的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。然而，產(chǎn)嗜熱β-葡萄糖苷酶的極端微生物生長(zhǎng)所需的條件一般難以達(dá)到，所以，目前通過采用基因工程手段，實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)嗜熱β-葡萄糖苷酶已成為各國(guó)的研究熱點(diǎn)之一。激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）作為絕對(duì)厭氧的極端嗜熱微生物，其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可能是日前熱穩(wěn)定性和酶活最好的β-糖苷鍵水解酶之一。因此，本研究利用大腸桿菌E.coli Roset

3、ta重組表達(dá)該嗜熱β-葡萄糖苷酶基因，激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）嗜熱β-葡萄糖苷酶基因的成功表達(dá)及其活性包涵體的成功發(fā)現(xiàn)，對(duì)于推進(jìn)木質(zhì)纖維素的高效生物轉(zhuǎn)化及酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)將具有重要意義。主要研究結(jié)果歸納如下:
　　1)本論文以Pyrococcusfuriosus的基因組DNA為模板，通過PCR獲得了嗜熱β-葡萄糖苷酶基因，將其與表達(dá)載體pET24a(+)連接，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)-P

4、F0073。
　　2)將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli Rosetta中得到成功表達(dá)，優(yōu)化其誘導(dǎo)表達(dá)條件后對(duì)其水解纖維二糖的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。得出，該重組β-葡萄糖苷酶的最適pH和溫度為5.0和95℃，在pH4.0-8.0和80-90℃范圍內(nèi)，具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。該重組β-葡萄糖苷酶的比酶活為222.94 U/mg，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值為16.9 mM，Vmax為0.6279μM/min。1mM的金屬離子（如Li

5、+、Ca2+、Co2+等）和10mM的EDTA以及糠醛對(duì)其活性影響不大，其對(duì)乙醇的耐受性良好， Ki值達(dá)到150g/L，對(duì)葡萄糖的耐受性略差，Ki值為200mM。
　　3)本研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白表達(dá)過程中形成具有水解纖維二糖能力的活性包涵體(BGL-AIBs)。在37℃和25℃條件下對(duì)BGL-AIBs的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出兩個(gè)溫度下的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件均為OD600為1.2、誘導(dǎo)時(shí)間為14h、IPTG濃度為0.25mM，且兩者相