小麥抗蚜蟲基因PPA的花粉管通道法轉(zhuǎn)化.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缈偖a(chǎn)量第二的糧食作物，病蟲害是造成小麥減產(chǎn)及糧食品質(zhì)下降的重要原因。每年全球糧食總產(chǎn)量因蟲害造成的損失超過(guò)10％。因此，有效的防治糧食作物的害蟲，是糧食增收的重要途徑。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，小麥蚜蟲主要還是采用農(nóng)藥防治的方法。噴灑農(nóng)藥不但增加生產(chǎn)成本還嚴(yán)重影響環(huán)境、破壞生態(tài)平衡。
　　 本課題主要分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)階段:第一階段將掌葉半夏中的抗蚜蟲基因PPA構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1380上并將該質(zhì)粒儲(chǔ)存在大腸桿菌DH5

2、α菌株中。載體構(gòu)建時(shí)，先用PCR儀分別擴(kuò)增載體pCAMBIA1380上的CAMV35S啟動(dòng)子、PBl122上的PPA基因和PTCK303上的GUS報(bào)告基因再將三種擴(kuò)增產(chǎn)物分別與T載體連接并酶切、測(cè)序鑒定，鑒定成功后，再利用酶切、回收等方法將這三段基因從T載體上切下連到表達(dá)載體pCAMBIA1380上;第二階段是從大腸桿菌中提取出合適濃度和用量的構(gòu)建好的質(zhì)粒并做PCR鑒定，鑒定為陽(yáng)性后，在合適的時(shí)間用花粉管通道法將其轉(zhuǎn)入小麥細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后

3、的小麥需與其它小麥品種隔離，細(xì)心培養(yǎng)直至結(jié)出T1代種子，再將T1代種子種下培養(yǎng)后代轉(zhuǎn)基因植株;第三階段則是鑒定出轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性植株并做匯總分析以及驗(yàn)證陽(yáng)性植株的抗蟲效果。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:花粉管通道法轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的T1、T2代小麥細(xì)胞中還有質(zhì)粒存在，PCR鑒定結(jié)果大部分為假陽(yáng)性，隨著細(xì)胞的分裂與分化，T3代植株中的質(zhì)粒已經(jīng)徹底消失，最后鑒定得到的陽(yáng)性植株基因組中真正整合了PPA基因。而放蟲實(shí)驗(yàn)一方面驗(yàn)證了PPA基因抗蚜功能的有