農(nóng)桿菌及花粉管通道法介導(dǎo)‘魏可’葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、本研究以‘魏可’葡萄(VitisviniferaL.Wink)為試材，由大田植株獲得其無(wú)菌系組培苗，并建立高效的再生體系，在此基礎(chǔ)上建立根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)‘魏可’葡萄的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并采用花粉管通道法對(duì)大田植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以期為‘魏可’葡萄的品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)探討了影響‘魏可’葡萄再生效率和遺傳轉(zhuǎn)化效率的各個(gè)因素，研究結(jié)果如下:
　　 1.研究了不同激素配比、外植體類型及暗培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)其器官再生效率的影響。結(jié)果表明:細(xì)

2、胞分裂素TDZ對(duì)‘魏可’葡萄葉片的再生效果比6-BA好;暗培養(yǎng)時(shí)間為2周或3周時(shí)，‘魏可’葡萄葉片可獲得較高的再生率;除幼根外，葉片、葉柄、莖段外植體均可再生出不定芽。葉片在MS+4mg/LTDZ+0.1mg/LIBA上培養(yǎng)，不定芽再生率可達(dá)78.74％±1.60，增殖系數(shù)為6.75±0.75;葉柄在MS+2mg/LTDZ+0.1mg/LIBA上培養(yǎng)，不定芽再生率為39.33％±1.47，增殖系數(shù)為3.55±0.50;莖段的最適激素組合

3、為MS+2mg/LTDZ+0.1mg/LIBA，再生率達(dá)41.37％±1.13，增值系數(shù)為4.74±0.64。暗培養(yǎng)0到4周處理中，暗培養(yǎng)2周或3周，葉片外植體可獲得較高的再生率。再生不定芽置于3/4MS+0.35mg/LIBA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，可獲得完整的植株。植株繼代培養(yǎng)35-50天后煉苗移栽，成活率可達(dá)90％。
　　 2.以‘魏可’葡萄離體葉片作為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化nptⅡ基因的受體，對(duì)農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、卡那霉素

4、選擇壓及羧芐青霉素濃度等因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:農(nóng)桿菌侵染4min，共培養(yǎng)3d，卡那霉素選擇壓5mg/L，羧芐青霉素濃度200mg/L，是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)‘魏可’葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系的較優(yōu)組合。
　　 3.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系對(duì)‘魏可’葡萄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了9個(gè)抗性株系，利用PCR擴(kuò)增檢測(cè)，有4個(gè)株系呈陽(yáng)性，其中1個(gè)株系RT-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性。將PCR產(chǎn)物回收，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證nptⅡ基因已經(jīng)完全整合進(jìn)入‘魏可’葡萄基因組中。對(duì)CK及

5、經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的株系進(jìn)行卡那霉素抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)在Kan為5mg/L時(shí)，PCR呈陽(yáng)性的株系抗性均明顯強(qiáng)于CK，初步證明整合進(jìn)入‘魏可’葡萄的nptⅡ基因得到了表達(dá)。
　　 4.以‘魏可’葡萄花序?yàn)檗r(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化nptⅡ基因的受體，利用花粉管通道法對(duì)‘魏可’葡萄花序進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將所得種子播種，共獲得140個(gè)后代單株。利用PCR及RT-PCR方法對(duì)其中70個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)，得到8個(gè)PCR陽(yáng)性單株，2個(gè)RT-PCR陽(yáng)性單株。將CK和PC