利用10Fn3噬菌體庫篩選RON胞外段結(jié)合蛋白.pdf

1、背景：巨噬細胞刺激蛋白（MSP）受體酪氨酸激酶（RON），是酪氨酸激酶受體亞家族成員之一，通常在上皮細胞、單核巨噬細胞、粒細胞、肺、骨髓等多種正常細胞中均有表達。研究表明，RON的異常表達與多種細胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的侵襲等有很大的關系，因此抑制RON的異常表達對于癌癥的治療具有重要的臨床意義。隨著細胞生物學的發(fā)展，已研究制備出了抗RON的單克隆單體。但由于該單克隆抗體分子質(zhì)量比較大而難以進入組織發(fā)揮作用、來源于免疫小鼠而在人體內(nèi)易發(fā)生免

2、疫排斥反應等缺點，限制了其在臨床上的應用。隨著噬菌體展示技術的快速發(fā)展，利用該技術制備的人源化的以及全人源的抗體即克服了鼠單克隆抗體異源性的缺點，又保留了其均一性、特異性強的優(yōu)點雖然噬菌體抗體庫的發(fā)展為人源抗體的制備提供了新思路，但利用該技術制備的抗體其分子量依然很大、結(jié)構相對復雜、需經(jīng)過一定的修飾（糖基化，加入二硫鍵等）才能發(fā)揮功能。因此，利用與抗體功能類似的小分子蛋白為骨架構建噬菌體隨機多肽庫，并利用噬菌體展示技術從中篩選出與靶標分

3、子結(jié)合的高親和的小分子多肽已經(jīng)成為人們制備新型抗體的新方法。自然界中存在多種骨架蛋白，其二級結(jié)構具有與重要蛋白相互作用的活性位點，如環(huán)狀(loop)結(jié)構、α-螺旋或β-折疊等，具有這些結(jié)構的骨架蛋白暴露在外邊的某些堿基組成的結(jié)合位點與抗體的互補決定域(Complementarity Determining Region，CDR)具有相似功能，使得這些骨架蛋白具有了構建隨機多肽庫的可能。其中骨架蛋白第十人纖維素類型III域（The ten

4、th human fibronectin type III domain，10Fn3)就是一種常見的骨架蛋白，其在人總蛋白中約占2％，含量比較高，在細菌噬菌體中也有發(fā)現(xiàn)。因為10Fn3結(jié)合了多種用于治療用分子的特征而在1998年第一次被提出作為支架構建噬菌體隨機肽庫。與其他骨架相比，10Fn3具有免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）樣結(jié)構域，并且在N端和C端存在能夠與大分子結(jié)合的β-折疊樣非連續(xù)循環(huán)結(jié)構。此外疏水核心的Ig樣

5、域提供了一個穩(wěn)定的框架結(jié)構，使10 fn3具有較高的熱穩(wěn)定性(Tm約為88℃)。重要的是，與可變的Ig相比，作為一種單體、缺乏穩(wěn)定的半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)錄后修飾、在細菌中快速高效表達的10Fn3，其結(jié)構是比較穩(wěn)定的。在本實驗中，我們選取了10Fn3作為支架，并將BC和FG循環(huán)結(jié)構中的氨基酸隨機化，依此構建了限制性的構象型隨機肽庫，并利用噬菌體展示技術，從中篩選出了與RON結(jié)合的高親和力小分子蛋白的陽性克隆。
　　目的：構建以骨架蛋白10

6、Fn3為基礎的噬菌體隨機肽庫，并從該隨機多肽庫中篩選出與RON胞外段結(jié)合的高親和力蛋白的陽性克隆。
　　方法：⑴應用RT-PCR技術從乳腺癌細胞MDA-MB-231中釣取RON細胞外段區(qū)域的基因。⑵分別構建RON細胞外段的克隆載體和表達載體。⑶采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法，將表達載體轉(zhuǎn)染進293T細胞，收取上清液并純化出RON細胞外段基因表達的蛋白。⑷通過重疊延伸PCR獲得以骨架蛋白10Fn3為基礎的噬菌體隨機多肽庫的基因，并將其通過酶切位

7、點SfiⅠ和NotⅠ與表達載體pCantab5E連接。⑸電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-Blue，建立初級噬菌體隨機肽庫。菌液PCR和挑取陽性克隆并送公司進行測序，分別鑒定構建的噬菌體隨機多肽庫的插入率和多樣性。⑹分別包被10μg/ml、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL，0.63μg/mL,0.31μg/mL和50μg/ml、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，3.13μg/mL,1.56μg/mL比較抗原包

8、被濃度對篩選富集結(jié)果的影響，然后用1×、4×、8×、12×、16×、20×PBST和1×、2×、4×、8×、10×、14×PBST依次洗滌比較篩選環(huán)境的苛刻程度對篩選富集結(jié)果的影響。⑺通過ELISA篩選出與RON胞外段結(jié)合的高親和力蛋白的陽性克隆。
　　結(jié)果：①成功構建了RON細胞外段區(qū)域的真核表達載體。②成功表達純化出抗原RON細胞外段蛋白。③成功構建了庫容量達1.92×107的噬菌體隨機肽庫，并成功從中篩選出了22個與RON結(jié)

9、合蛋白待篩選克隆。④通過對本實驗中篩選條件的比較，確定了洗滌條件對富集度的影響要大于RON包被濃度的影響。
　　結(jié)論：⑴構建了一個庫容量為1.92×107的噬菌體隨機肽庫，建立了一個噬菌體隨機多肽庫的技術平臺，篩選出了RON胞外段結(jié)合蛋白的陽性克隆，為以后其功能的檢測提供了分子基礎。⑵通過對篩選過程中RON包被濃度及洗滌條件對富集效率的影響的比較，確定在篩選RON結(jié)合分子的過程中，PBST洗滌濃度即洗滌條件嚴格度的影響要高于包被R