天然人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選.pdf

1、抗體技術(shù)經(jīng)歷了多克隆抗體血清、單克隆抗體、基因工程抗體的發(fā)展階段，其中突出的進展是噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)?？贵w庫技術(shù)源于噬菌體表面展示技術(shù)的發(fā)展，即將單鏈scFv或Fab抗體呈現(xiàn)在噬菌體表面?？贵w庫技術(shù)已經(jīng)成為篩選特異性抗體的強有力工具，尤其是大容量通用性噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選技術(shù)在不斷得到改進，其庫容可達1013-14，其應(yīng)用范圍也在不斷擴展，為高通量快速篩選特異性抗體提供了簡便和高效的可操作系統(tǒng)，使得不經(jīng)免疫既可獲得各種特異性抗體

2、。 噬菌體抗體庫分為合成抗體庫、半合成抗體庫和天然抗體庫(免疫或非免疫抗體庫)。從免疫抗體庫只能獲得針對免疫抗原的抗體，抗體基因片段來源于經(jīng)抗原免疫過的供體，從其脾臟或外周血B細胞中擴增得到V區(qū)基因構(gòu)建而成，該文庫具有較強的抗原特異性和親合力。 相對于免疫庫，更為理想的是構(gòu)建無抗原偏向性的文庫，可以針對多種人類抗原同時進行篩選。通過收獲正常人外周血淋巴細胞、脾細胞、骨髓細胞等mRNA，擴增抗體基因克隆到噬菌體載體后形成的

3、天然非免疫性通用性抗體庫含有大量識別不同抗原的抗體基因。與雜交瘤技術(shù)和免疫庫相比，其具有許多優(yōu)點：可以分離到針對自身抗原、無免疫原性或毒性抗原的抗體；一個抗體庫可以用于多種抗原篩選而獲得多種抗體產(chǎn)生；在庫容量足夠大的時候可以獲得高親和力抗體。但是天然庫也存在一些局限性：在庫容量較小時分離到低親和力抗體；構(gòu)建抗體庫時間比較長；抗體庫的質(zhì)量和大小受可變區(qū)基因表達情況的影響；B細胞捐贈者的免疫歷史不清楚和IgM庫潛在多樣性的限制。 本

4、研究利用噬菌體抗體庫技術(shù)和Cre-Loxp定位重組系統(tǒng)，構(gòu)建了一個大容量天然噬菌體抗體庫和一個HCV免疫庫，用眼睛蛇毒和HCV抗原分別利用兩個噬菌體抗體庫進行篩選以獲得人源抗體。為構(gòu)建具有良好多樣性的抗體庫，我們采集了150份正常人和2份丙型肝炎病人的外周血，分離淋巴細胞，提取細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，分別以不同的人源抗體基因引物擴增抗體輕重鏈基因。首先將輕鏈基因按照人類抗體基因使用頻率的比例混和(K：60％λ：40％HVK1:19.

5、2％HVK2:10.2％HVK3:30.6％HVL1:14.8％HVL2:13.2％HVL3:9.2％)，插入到pDF和pComb3X質(zhì)粒中，通過多次電轉(zhuǎn)化，鋪板刮細菌收獲含有輕鏈庫質(zhì)粒，然后將重鏈按照人類抗體基因使用頻率的比例(HVH1:38％HVH2:34％HVH3:2％HVH4:26％)，混合后插入輕鏈質(zhì)粒獲得含有8×108克隆的初級非免疫抗體庫，和7×106的免疫抗體庫。 初級噬菌體抗體庫以高感染復(fù)數(shù)(MOI>100:1

6、)感染能分泌重組酶的大腸桿菌BS1365，使多個噬菌體同時感染一個細菌，低溫誘導(dǎo)定點重組，收獲的重組噬菌體抗體庫以低感染復(fù)述(MOI<1:1)感染大腸桿菌XL1-Blue，噬菌體的基因型和表型得到統(tǒng)一，收獲噬菌體獲得含有9×1010克隆的噬菌體抗體庫，隨機挑取10個克隆鑒定，輕鏈和重鏈均有插入的8個克隆，插入率為80％。隨機挑選96個克隆測序，獲得的序列結(jié)果表明沒有重復(fù)的序列，序列分析表明輕重鏈各亞型分布基本符合人類抗體基因使用頻率的比

7、例。 用HCVNS4和Cobravenom對天然庫進行了4輪富集篩選，4輪富集篩選的富集效果明顯。隨機挑選4輪富集篩選后的單克隆誘導(dǎo)表達后的上清進行初步檢測。用HCVNS4對免疫庫進行了4輪富集篩選，4輪富集篩選的富集效果明顯。隨機挑選4輪富集篩選后的單克隆誘導(dǎo)表達后的上清進行初步檢測。用96孔板進行高通量的克隆篩選，獲得了41株具有Fab活性的抗體克隆，4株特異性的針對HCVNS4，一株針對Cobravenom，篩選結(jié)果并不理

8、想，還需要進一步調(diào)整實驗條件來獲得特異性的抗體克隆。 本研究利用噬菌體抗體庫技術(shù)，采集丙型肝炎感染患者的外周血初步構(gòu)建了一個丙型肝炎的免疫庫，采集多份正常健康人外周血利用Cre-Loxp定位重組系統(tǒng)，構(gòu)建了大容量的天然噬菌體抗體庫并對抗體庫的序列分布進行了分析；并用眼鏡蛇毒和HCV抗原，利用兩個抗體庫進行篩選，獲得了41株具有Fab活性的抗體克隆，1株特異性的針對眼鏡蛇毒抗原，4株特異性的針對HCV抗原，從天然抗體庫中篩選特異性