利用噬菌體12肽庫篩選針對雞IBDV單抗的模擬表位.pdf

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所早交的論文是我個人在導師指導下進行的研究T作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中一i包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也彳i包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同丁_作f1勺同志劃本研究所做的任何貢獻均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。缸時間：押)午勿“j關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完仝了解安徽農(nóng)業(yè)大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權(quán)

2、保留送交論文的復印件和磁盤允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學使論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文n勺全部或部分內(nèi)容。(保密的學位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)導師簽名：嘲’口J№“月6：1時間：力。／p年舌月∥Lj摘要lIllImlIIIIIILIII／IIIIIIIIIIllY2149984由傳染性法氏囊炎病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IB

3、DV)引起n7jlBD是雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBDV主要侵害3—12周1出E。／x孤／／雞或青年雞的中樞免疫器官法氏囊，嚴重感染可導致發(fā)病雞死亡；存活雞則由于法氏囊損傷而造成全身性免疫抑制，結(jié)果因免疫能力下降，易感染其他傳染病。該病呈世界性分布，是危害禽類養(yǎng)殖的三大疫病之一。目前還沒有特效的藥物治療此病，因此IBDV高效疫苗的研究變得刻不容緩IBDV抗原表位的確立有助于表位疫苗的研究。研究表明，IBDV屬雙RNA病毒科(Bi

4、max，iridaefamilx，)的雙RNA病毒屬(Avanbimax’irus)?；蚪M包括A軍IIB兩個片段。A片段編碼VP24—3和VP5組成的多聚蛋白；其中VP27FIIVP3為主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP4為病毒自身蛋白酶，而VP5只能在IBDV感染的細胞中被檢測。B片段編碼VPl蛋白，為RNA依賴的RNA聚合酶。迄今，在IBDVn勺VP2及VP3上發(fā)現(xiàn)多個抗原表位序列。本研究利用噬菌體肽庫對實驗室保存n93株IBDV單克隆抗體(H5

5、3、V1和V38)進行生物淘選，淘選出與IBDV單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體株，進而通i立ELISA篩選出能與IBDV競爭性結(jié)合IBDV單克隆抗體的噬菌體株，測序分析其序列后獲得IBDV的抗原表位。具體操作如下：首先：將實驗室保存fl93株IBDV單克隆抗體(H53、V1nv38)細胞株進行復蘇培養(yǎng)，3株雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價分別為1：256、1：64和1：128。3株雜交瘤細胞分別注射8周齡1|gBalb／c小鼠腹腔制備腹水，ELIS

6、A沏0定腹水效價分別達1：210j，3X1041105以上。H53，V1矛HV38的亞類鑒定均為IgG2b。采用辛酸一飽和硫酸銨法對3株單克隆抗體提純，純化后的單克隆抗體經(jīng)SDSPAGE出現(xiàn)2條帶，分別為IgG99輕鏈與重鏈。應(yīng)用凝膠分析軟件對蛋白質(zhì)條帶進行光密度掃描，三株單克隆抗體的純度分別為995％，986％H991％。通過間接ELISA軔19定樣品效價，達16X104。經(jīng)處理的單克隆抗體具有較高的純度和活性，能夠保證親和篩選過程中

7、與噬菌體的特異性結(jié)合。其次，利用噬菌體隨機12肽庫對單克隆抗體H53、V1、V38進行4輪淘選，通過逐輪降低包被濃度及增加洗脫時間來提高單克隆抗體與噬菌體的特異性結(jié)合。隨機挑取30個噬菌體克隆，通過噬菌體ELISA鑒定后獲得22個陽性噬菌體克?。贿M一步用競爭ELISA獲得14個噬菌體株能抑制單克隆抗體與IBDVIj9結(jié)合，其抑制率達50％以上。最后，測定14株噬菌體單克隆寧列。通過DNAStar軟件分析12肽序列，比對找出共有序列。總之