氧氟沙星噬菌體抗體庫構(gòu)建及篩選.pdf

1、食品安全已經(jīng)成為一個世界性的挑戰(zhàn)和全球重要的公共衛(wèi)生問題，其中動物源性食品安全是世界關(guān)注的一個焦點(diǎn)，其中獸藥殘留問題是影響動物源性食品安全的主要因素之一，喹諾酮類獸藥中的氧氟沙星以其諸多優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用，因此其在動物源性食品中殘留的可能性非常大。ELISA方法逐漸成為一種成熟的藥物殘留快速分析方法，而獲得理想的抗體是制約ELISA方法發(fā)展的主要瓶頸問題。為了獲取更為有效的抗體，本研究構(gòu)建了氧氟沙星特異性噬菌體抗體庫，并對抗體庫進(jìn)行了淘選。

2、
　　從106-107個分泌氧氟沙星抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用兼并引物分別擴(kuò)增得到長度約為450bp的重鏈可變區(qū)基因VH及長度約為440bp的輕鏈可變區(qū)基因VL，通過重疊延伸PCR拼接為單鏈抗體(scFv)基因片段，其長度約為780bp。經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，用T4DNA連接酶將其與T7噬菌體載體進(jìn)行連接，進(jìn)行蛋白包裝之后成功構(gòu)建氧氟沙星噬菌體抗體庫，經(jīng)檢測原始噬

3、菌體抗體庫的滴度為2.4×105pfu。將原始抗體庫進(jìn)行液體擴(kuò)增，經(jīng)檢測擴(kuò)增后的噬菌體抗體庫滴度為1.2×1012pfu/mL。以氧氟沙星-OVA（雞卵白蛋白）為配體對抗體庫進(jìn)行淘選，每輪淘選的噬菌體投入量為1010pfu/mL，共進(jìn)行4輪淘選。在淘選過程中，分別對封閉條件和洗脫方法進(jìn)行了優(yōu)化。封閉液分別用5％BSA、5％乳粉、10％乳粉進(jìn)行對比，結(jié)果顯示5％BSA效果較好。淘選后的洗脫嘗試了兩種洗脫方法:用1％SDS進(jìn)行洗脫的方法和用

4、對數(shù)期的宿主菌(BLT5403)進(jìn)行原位洗脫的方法，結(jié)果顯示原位洗脫方法具有較好的效果。從第四輪淘選的平板中挑取138個噬菌體單克隆，分別摳斑浸于提取緩沖液中，4℃過夜之后，以其為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明83％的克隆含有正確長度的單鏈抗體基因。通過噬菌體ELISA對淘選后噬菌體克隆的特異性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示4個克隆體現(xiàn)出較高的特異性，1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品對其抑制率分別為31％，35％，33％，78％。對特異性最高的單鏈抗體基因進(jìn)行測序