中國(guó)人PSMA蛋白的制備及其Fab噬菌體抗體庫(kù)的篩選.pdf

1、目的:該課題擬利用RT-PCR技術(shù),從前列腺癌晚期患者的癌組織中克隆出PSMA的cDNA全長(zhǎng),構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET30a(+)-PSMA.在IPTG誘導(dǎo)下,誘導(dǎo)表達(dá)PSMA,利用親和層析技術(shù),以Ni-NTA樹(shù)脂對(duì)PSMA進(jìn)行初步純化.以純化后的PSMA為抗原,對(duì)已構(gòu)建的前列腺癌患者噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選,在Elisa檢測(cè)鑒定下,挑取高親和力噬菌體抗體克隆,然后以多種腫瘤細(xì)胞株為抗原對(duì)獲得的抗體克隆進(jìn)行交叉篩選,獲得與PSMA特異性高效

2、結(jié)合的抗體克隆.從而得到針對(duì)PSMA的人源性Fab噬菌體抗體序列,為抗體Fab片段的篩選、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ).研究結(jié)論:1.分段克隆基因,然后將基因在分別連接到同一載體,可以有效解決一些長(zhǎng)片段基因克隆中堿基錯(cuò)配的問(wèn)題.在國(guó)內(nèi)首次成功克隆到序列完全正確的中國(guó)人PSMA的cDNA,并構(gòu)建了PSMA的原核表達(dá)重組子pET30a(+)-PSMA,為以后的PSMA表達(dá)、純化及其抗體庫(kù)的篩選奠定了基礎(chǔ).2.用原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)PSMA,由于

3、其分子量大,結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn),誘導(dǎo)表達(dá)的量較少而且無(wú)法確定其生物活性和抗原性,通過(guò)SDS-PAGE和Western-Blotting證實(shí),成功獲得了PSMA,并且具有良好的抗原性和特異性.3.用原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)PSMA,由于其分子量大,結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn),誘導(dǎo)表達(dá)的量較少,這對(duì)后期的純化造成較大的困難,通過(guò)改變裂解液、沖洗液和洗脫液中咪唑的濃度可以有效提高純化效果.4.由于純化的PSMA純度不夠,這篩選造成一定的影響.但是通過(guò)擴(kuò)大挑取克隆數(shù)