利用噬菌體肽庫技術(shù)篩選SARS冠狀病毒N蛋白B細(xì)胞表位的研究.pdf

1、研究背景與目的：SARS的流行給人民的身體健康和社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大的威脅。目前對SARS尚無特效的治療措施，80％的患者在前兩個階段，即病毒復(fù)制期和超敏反應(yīng)期，經(jīng)過及時有效的器械輔助及藥物治療后可出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，并最終治愈。由于該病是新近發(fā)生的傳染病，造成的危害已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了疾病本身的范疇，有關(guān)的發(fā)病機(jī)制、診斷及防治等方面的深入研究均是急需解決的問題。 核衣殼(N)蛋白是SARS冠狀病毒(SARS-CoV)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，位于SAR

2、S-CoV的核心，由422個氨基酸組成，分子量約46kDa。N蛋白在宿主細(xì)胞質(zhì)中合成后迅速磷酸化，并和包膜蛋白的羧基末端與病毒基因組RNA結(jié)合形成核衣殼。綜合目前對N蛋白的研究成果，可知N蛋白廣泛分布在SARS病人的多個器官和組織，其基因組序列基本保守，具有良好的抗原性。研究表明針對N蛋白的抗體產(chǎn)生早，引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)烈而持久，所以N蛋白不僅是SARS疫苗的候選分子，而且是良好的可應(yīng)用于病毒感染早期診斷的靶抗原。 本實(shí)驗(yàn)室曾用滅

3、活的SARS全病毒免疫小鼠，并通過一系列的篩選和配對試驗(yàn)，得到88株親和力高、特異性強(qiáng)的抗SARS-CoVN蛋白的單克隆抗體。本研究擬選擇這些單克隆抗體與N蛋白進(jìn)行ELISA配對試驗(yàn)，鑒定出針對N蛋白不同表位的單克隆抗體，然后利用這些單抗采取ELISA夾心法親和篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫，最后通過測序分析得到N蛋白的不同表位，然后繪制表位圖。為SARS的早期診斷及SARS基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 方法：利用本實(shí)驗(yàn)室提供的抗SAR

4、S-Cov的單克隆抗體與SARS病毒N蛋白進(jìn)行配對試驗(yàn)，以不同表位的單抗作為固相篩選分子包被96孔板親和篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫，經(jīng)過3～5輪的篩選后在LB-IPTG/Xgal平板上隨機(jī)挑取分隔良好的克隆，分別進(jìn)行夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))試驗(yàn)，陽性克隆在排除交叉反應(yīng)后提取噬菌體單鏈DNA，經(jīng)過0.7％瓊脂糖電泳鑒定后進(jìn)行測序，按照測得的DNA序列推導(dǎo)出其氨基酸序列(DNA序列的測定采用Biolabs公司提供的自動測序引物：5'-

5、HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3')，得到的序列再與原始N蛋白序列進(jìn)行比較分析得出N蛋白的保守肽段，即為N蛋白的表位。本實(shí)驗(yàn)利用合成肽對N蛋白表位進(jìn)行了鑒定，其肽的合成由北京塞百盛生物技術(shù)有限公司合成。 結(jié)果：對純化效果較好的9株抗SARS-CoVN蛋白的單克隆抗體經(jīng)過ELISA配對篩選后得到4株(mAbC008、mAbC039、mAbC011、mAbC005)針對N蛋白不同表位的單抗，以這些單克隆抗體作為固相篩

6、選分子親和篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫，經(jīng)過3～5輪的篩選后在LB-IPTG/Xgal平板上隨機(jī)挑取分隔良好的各46個克隆，經(jīng)過ELISA夾心法鑒定出mAbC00835個陽性、mAbC03941個陽性、mAbC01128個陽性、mAbC00525個陽性克隆，對這些陽性噬菌體克隆進(jìn)行與封閉液的交叉反應(yīng)試驗(yàn)后，分別確定出各有33株、37株、22株和20株陽性克隆。將這些陽性噬菌體克隆再以碘化鈉溶液抽提噬菌體單鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后測序，按

7、照測得的DNA序列推導(dǎo)出其氨基酸序列，得到的序列再與原始N蛋白序列進(jìn)行比較分析得出N蛋白的保守肽段，即以mAbC008作為固相篩選分子，GLXXXTPXXGXT占陽性總數(shù)的62.8％，其第1、3、5、6、11和12位置上的氨基酸殘基和SARS病毒N蛋白137～148位氨基酸序列(GALNTPKDHIGT)有較高的同源性，說明12肽序列中這些位置上的氨基酸殘基高度保守，可能是該抗原的一個表位骨架結(jié)構(gòu)；以mAbC039作為固相篩選分子，TT

8、LPXXXXAXXX占陽性總數(shù)的94.1％，其第1、2、3、4、9位置上的氨基酸殘基與SARS病毒N蛋白165～176位氨基酸序列(TTLPKGFYAEGS)有較高的同源性，可能是該抗原表位的另一骨架結(jié)構(gòu)；以mAbC011作為固相篩選分子的為PXXXXXWXTXXT占陽性總數(shù)的63.2％，其第1、7、9、12位置上的氨基酸殘基與SARS病毒N蛋白46～57位氨基酸序列(PNNTASWFTALT)有較高的同源性，可能是該抗原的又一表位骨架

9、結(jié)構(gòu)；以mAbC005作為固相篩選分子的為XXXXLSPXXXFX占陽性總數(shù)的55％，其第5、6、7、11位置上的氨基酸殘基與SARS病毒N蛋白100～111位氨基酸序列(KMKELSPRWYFY)有較高的同源性，可能也是該抗原的又一表位骨架結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：利用ELISA法配對篩選出4株針對不同表位抗SARS-CoVN蛋白的單克隆抗體，用這些單抗作為固相篩選分子親和篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫，成功得到了4個N蛋白的不同表位，即以mAb

10、C008、mAbC039、mAbC011、mAbC005作為固相篩選分子的表位分別是：GLXXXTPXXGXT、TTLPXXXXAXXX、PXXXXXWXTXXT和XXXXLSPXXXFX，其中TTLPXXXXAXXX與YuxianHe(2004)報道的SARS病毒N蛋白的一個優(yōu)勢表位相符，另外幾個表位為國內(nèi)外首次報道；本實(shí)驗(yàn)先用以mAbC008作固相篩選分子得到的GALNTPKDHIGT表位和以mAbC039作固相篩選分子得到的TTL