雜質譜分析技術在化藥注射劑雜質控制中的應用研究.pdf

1、藥品安全直接關系人類健康，是重大的民生和公共安全問題。注射劑作用迅速，是臨床應用最廣泛、最重要的劑型之一，目前已大量入選國家基本藥物目錄。近年來，由于注射劑生產(chǎn)工藝以及滅菌工藝的不合理性引發(fā)的不良反應事件時有發(fā)生。欣弗注射液不良反應、刺五加注射液不良反應等典型藥害事件，使患者對注射劑的安全性產(chǎn)生了質疑。藥品中存在的各種雜質特別是毒性雜質與這些不良反應的發(fā)生密切相關。鑒于注射劑原料合成工藝、處方組成以及滅菌工藝的復雜性，雜質來源各異、種類

2、眾多、成份復雜，而僅依靠傳統(tǒng)單一色譜分析方法很難對雜質信息作出準確、客觀、完整的判斷。因此，亟需建立一套全面、系統(tǒng)、準確的注射劑雜質分析方法。
　　目前，藥物雜質研究普遍采用“雜質譜控制”理念，雜質譜分析技術是針對藥品中的每一個雜質，依據(jù)其生理活性制定相應的質控限度，即藥品中的所有雜質都能被有效的分離，每一個雜質的來源與結構已知，每一個雜質的生理活性清楚，且質控分析方法具有良好的粗放性(ruggedness)。涉及的科學問題可簡單

3、概括為:復雜體系樣本的分離分析、微量組分的結構分析和微量組分的毒性評價三方面問題。然而，當前多數(shù)藥品質量標準中雜質質量控制方法、特定雜質和雜質的控制限度遠不能有效控制產(chǎn)品的安全性，亟需進一步提升標準。
　　本論文以國家藥品安全“十二五”規(guī)劃為依托，利用雜質譜分析技術，通過與其它化學、生物技術的交叉結合，開展從工藝分析、雜質篩查到雜質定向合成、結構確認、分離測定，再到藥理毒性評價的系列研究，力圖對注射劑中的雜質組成以及其毒性、藥效關

4、系進行全面深入地分析，為提高注射劑的質量及臨床用藥安全提供依據(jù)。
　　本論文研究和發(fā)展了傳統(tǒng)的雜質譜分析技術，以液相分離技術為基礎，建立和優(yōu)化高效液相色譜方法，有效結合二維液相串聯(lián)四級桿軌道阱質譜(2DLC-QEMS)、MassFrontier化合物結構解析技術，將之應用于注射劑的雜質分離和分析中，采用Derek軟件和Sarah軟件并結合Ames試驗方法對新發(fā)現(xiàn)雜質的生物特性，尤其是基因毒性開展了進一步的研究，為多種注射劑雜質的國

5、家標準的制訂提供了依據(jù)，同時，也為雜質譜分析技術中關鍵技術的發(fā)展和完善提供了新思路、新方法，為化學藥品的雜質研究提供了全新的分析技術方法。
　　第一部分緒論
　　介紹了本研究課題的背景以及雜質對藥物安全性的影響，并對雜質分析的常規(guī)方法進行了總結分析與概括，綜述了當前雜質研究現(xiàn)狀及雜質譜分析技術的研究進展，闡述了本論文的研究意義和通用方法思路。
　　第二部分米力農(nóng)注射液的雜質研究
　　以國家藥品抽驗平臺為依托，通過

6、比較分析全國范圍內米力農(nóng)注射液質量差異，結合米力農(nóng)注射液的生產(chǎn)工藝及影響因素試驗，采用新建立的液相色譜方法全面分析米力農(nóng)注射液的雜質，建立了米力農(nóng)注射液的雜質譜;采用液相制備、LC-MS、化學合成以及1HMR和MS等方法對雜質譜中的主要雜質進行定性，分離確證了2個雜質，其中雜質B為全新結構化合物，并采用Derek軟件和Sarah軟件對新發(fā)現(xiàn)雜質的生物特性尤其是其基因毒性進行了評價，雜質B無遺傳毒性，但存在皮膚刺激性，與米力農(nóng)注射液臨床不

7、良反應中的過敏反應、皮疹等不良反應相關，為降低這些不良反應的發(fā)生，將雜質B作為風險雜質進行控制，并根據(jù)ICH雜質研究指導原則并結合現(xiàn)有的國家藥品標準修訂了米力農(nóng)及米力農(nóng)注射液的質量標準，已被《中國藥典》2015年版收錄為法定標準，用于全國米力農(nóng)注射液的質量控制。同時，雜質B已獲得國家發(fā)明專利授權，研究成果已被中國食品藥品檢定研究院應用，發(fā)行的雜質B對照品用于全國米力農(nóng)注射液的質量控制。
　　第三部分氨酪酸注射液的雜質研究
　

8、　本研究采用雜質譜分析技術對氨酪酸及氨酪酸注射液中的雜質進行了系統(tǒng)的分析與研究，通過制備工藝的比較分析并結合國內不同地域來源樣品的測定結果，確定了氨酪酸樣品中存在的雜質，進而采用2D-LC-QEMS和MassFrontier推測出雜質的結構，采用化學合成及UV、IR、MS、1H-NMR及LC-MS對未知雜質進行結構確證和一致性確認。雜質Ⅱ作為氨酪酸雜質采用創(chuàng)新性的合成方法進行制備，解決了氨酪酸質量控制的關鍵性問題，目前該合成工藝已獲得國

9、家發(fā)明專利授權，專利號ZL201510077458.1。采用Derek軟件和Sarah軟件對雜質Ⅱ的生物特性，尤其是基因毒性進行了評價，基于統(tǒng)計的QSAR模型的Sarah軟件結果呈疑似陽性(17％);通過Ames試驗對雜質Ⅱ遺傳毒性進行了深入的研究，證實雜質Ⅱ無遺傳毒性，但因雜質Ⅱ在氨酪酸注射液中表觀含量較高，且為GABA二聚體結構，可能是引起頭暈、失眠等中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應的主要原因，因此，將雜質Ⅱ作為風險雜質進行了控制。提出了氨酪酸

10、及氨酪酸注射液雜質檢查的國家標準，現(xiàn)已被國家藥典委員會采納，同時研究成果還被東北制藥集團有限公司應用于日常的質量控制，使我國氨酪酸及其制劑的質量標準處于國際領先水平。
　　第四部分注射用BC-02的雜質研究
　　BC-02作為一種全新的抗腫瘤藥物，雜質研究方法未見文獻報道。本研究從雜質分離分析方法的篩選建立、雜質的定性分析以及雜質的毒性評價三個關鍵的技術層面，對創(chuàng)新藥物BC-02及其制劑的雜質進行了系統(tǒng)的分析與研究。探索研究

11、了一種適合于BC-02及其相關雜質分離分析的液相色譜方法，建立了能夠全面反映BC-02相關工藝與影響因素的雜質譜，建立的BC-02雜質分析方法已獲得國家知識產(chǎn)權局的發(fā)明專利授權（BC-02的液相色譜檢測方法專利號ZL201510077487.8）。采用二維色譜串聯(lián)高分辨質譜(2D-HPLC-QEplus)和MassFrontier軟件推測出7個雜質的化學結構，采用化學合成的方法對其中的4個雜質進行全合成，采用液相制備的方法對個雜質e、雜

12、質f進行了制備，通過質譜和元素分析方法進行了確證。經(jīng)Scifinder化合物庫檢索，雜質e和雜質f為全新的化合物。采用Derek和Sarah軟件對BC-02的7種雜質的遺傳毒性進行了評價，除雜質g(羥甲基-5Fu)為疑似遺傳毒性外，其余6個雜質的遺傳毒性均為陰性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，羥甲基5-Fu本身極不穩(wěn)定，且在樣品中未被檢出，不予控制;其他6種雜質具有肝毒性、眼毒性、皮膚過敏性等副作用，作為風險雜質控制。按照ICH指導原則和國家局CDE的要

13、求，結合雜質譜分析理念的關鍵技術，提出并制定了BC-02雜質控制的質量標準，使新藥BC-02質量標準控制達到了國際領先水平，為雜質譜分析技術在新藥研究中的拓展應用提供了良好的示范平臺。
　　第五部分總結與展望
　　對雜質譜分析技術的新發(fā)展和系統(tǒng)分析方法進行了總結，該方法可作為化學藥品雜質分析的通用技術方法;同時對米力農(nóng)注射液、氨酪酸注射液以及注射用BC-02的雜質研究過程和研究成果進行了匯總，并對本研究存在的技術問題和不足進

14、行了分析，為進一步開展后續(xù)研究工作指明了方向。
　　本論文以分析研究發(fā)現(xiàn)的藥品中潛在雜質出發(fā)，通過結合工藝分析與實驗篩查的發(fā)現(xiàn)途徑，采用現(xiàn)代色譜及聯(lián)用技術的分析手段，以軟件預測毒性評價技術和Ames試驗相結合的生物特性評價方式，為藥品中雜質的發(fā)現(xiàn)、分離和鑒定、測定提供了較為全面、系統(tǒng)的研究思路和方法。并對米力農(nóng)注射液、氨酪酸注射液以及注射用BC-02的雜質研究過程和研究成果進行了匯總，為進一步開展后續(xù)研究工作指明了方向。本論文雜質