草魚白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)表達(dá)的負(fù)調(diào)控機(jī)制及其在炎癥反應(yīng)中的意義.pdf

1、白細(xì)胞介素lβ(IL-lβ)是IL-1家族中最重要的成員之一。大量的研究表明，作為一種重要的促炎癥因子IL-lβ在炎癥和疼痛的發(fā)生、自身免疫疾病、先天和獲得性免疫反應(yīng)中都發(fā)揮著重要的作用。特別是在炎癥反應(yīng)中IL-lβ的誘導(dǎo)表達(dá)及調(diào)控機(jī)制在控制炎癥反應(yīng)強(qiáng)度和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著決定性的作用。
　　魚類IL-lβ在基因定位、蛋白結(jié)構(gòu)和分泌機(jī)制方面與哺乳動(dòng)物同系物既有相似性也存在較大差異，但是目前對(duì)于魚類IL-lβ誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍

2、然缺乏清楚的認(rèn)識(shí)。在本論文中以草魚為研究模型，在分析炎癥條件和重組草魚IL-lβ誘導(dǎo)IL-lβ表達(dá)的特征基礎(chǔ)上，證明IL-lβ受體II（IL-1RII）和抑炎癥因子（TGF-β1）參與了草魚IL-lβ誘導(dǎo)表達(dá)的負(fù)調(diào)控過程，并闡明了相關(guān)分子機(jī)制。研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.炎癥條件下草魚IL-1β的誘導(dǎo)表達(dá)：（1）通過同源克隆技術(shù)獲得草魚IL-1β的cDNA全序列，再采用生物信息學(xué)方法分析所得基因。（2）通過熒光定量PCR（qPCR）技

3、術(shù)發(fā)現(xiàn)草魚 IL-1β在草魚頭腎、肝、腎、胸腺、脾等免疫器官中表達(dá)量較高，證明草魚IL-1β發(fā)揮免疫功能的場(chǎng)所十分保守。（3）在細(xì)菌脂多糖（LPS）刺激草魚頭腎白細(xì)胞（HKL）的體外模型中，發(fā)現(xiàn) LPS可以迅速地誘導(dǎo) IL-1β的高表達(dá)但誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度隨著時(shí)間降低。（4）在嗜水氣單胞菌活體感染草魚的體內(nèi)模型中，發(fā)現(xiàn)感染后IL-1β的誘導(dǎo)表達(dá)迅速上升，但隨后又下降。體外體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)都表明在炎癥反應(yīng)條件下草魚IL-1β的誘導(dǎo)表達(dá)呈現(xiàn)快速和瞬時(shí)的

4、特征。
　　2.草魚 IL-1β的自我誘導(dǎo)表達(dá)：（1）通過重組表達(dá)和純化獲得了高純度重組草魚IL-1β蛋白，通過qPCR和檢測(cè)細(xì)胞活力的CCK8實(shí)驗(yàn)證明該重組蛋白具有生物學(xué)活性。（2）以重組草魚IL-1β蛋白為抗原委托制備多克隆抗體，通過免疫印跡（WB）實(shí)驗(yàn)證明所獲多克隆抗體能夠特異識(shí)別草魚IL-1β蛋白。（3）在重組草魚IL-1β蛋白刺激HKL后，發(fā)現(xiàn)重組IL-1β在1小時(shí)內(nèi)即可誘導(dǎo)自身表達(dá)，隨后誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)迅速降低，其細(xì)胞信號(hào)

5、傳導(dǎo)機(jī)制包括MAPK和NFκB信號(hào)通路。
　　3.草魚IL-1受體 II（IL-1RII）的分離鑒定及其對(duì) IL-1β誘導(dǎo)表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用：（1）通過同源克隆技術(shù)分離了草魚IL-1RII的cDNA全序列，生物信息學(xué)方法揭示了所得基因與其它物種同源基因之間的進(jìn)化關(guān)系。（2）采用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)草魚IL-1RII在肝、脾、頭腎和鰓組織中表達(dá)量較高。（3）在炎癥反應(yīng)條件下，草魚IL-1RII在體內(nèi)和體外模型中均可被誘導(dǎo)表達(dá)，而對(duì)照組的I

6、L-1RII基因表達(dá)水平均無變化，表明IL-1RII的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)于炎癥刺激的依賴性。（4）在重組草魚IL-1β蛋白刺激HKL的細(xì)胞模型中，重組草魚IL-1β可以通過MAPK和NFκB信號(hào)通路誘導(dǎo)草魚IL-1RII的表達(dá)。（5）通過重組表達(dá)、親和和分子篩層析分離純化獲得了高純度重組草魚IL-1RII的胞外區(qū)蛋白?；贓LISA的蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明重組草魚IL-1RII胞外區(qū)蛋白可以在體外與重組草魚IL-1β相結(jié)合。（6）重組草魚IL-1RI

7、I可以在體外顯著抑制重組草魚IL-1β對(duì)自身基因的誘導(dǎo)表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在炎癥反應(yīng)或草魚IL-1β刺激下產(chǎn)生的草魚IL-1RII可能是負(fù)調(diào)控草魚IL-1β表達(dá)的機(jī)制之一。
　　4.草魚抑炎癥因子對(duì)IL-1β誘導(dǎo)表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用：（1）不論在嗜水氣單胞菌感染的體內(nèi)模型還是LPS刺激HKL的體外模型中，草魚抑炎癥因子TGF-β1均被誘導(dǎo)高表達(dá)，而對(duì)照組的TGF-β1基因表達(dá)水平均無變化，表明TGF-β1可能參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。（

8、2）在草魚HKL中發(fā)現(xiàn)重組草魚IL-1β蛋白可以通過MAPK和NFκB信號(hào)通路誘導(dǎo)TGF-β1基因的表達(dá),提示TGF-β1可能以反饋方式參與IL-1β的調(diào)節(jié)作用。（3）草魚TGF-β1的抗體中和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)草魚TGF-β1抗體可以延長(zhǎng)IL-1β對(duì)自身誘導(dǎo)表達(dá)的作用時(shí)間，證明內(nèi)源性的TGF-β1參與了草魚IL-1β的自我誘導(dǎo)作用。（4）上述結(jié)論被以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：草魚HKL中重組草魚TGF-β1可以抑制重組草魚IL-1β的自我誘導(dǎo)表達(dá)作用。（

9、5）在機(jī)制方面, WB分析證明重組草魚TGF-β1可以通過抑制IκB的磷酸化來影響NFκB信號(hào)通路的激活，從而降低重組草魚IL-1β對(duì)自身基因的誘導(dǎo)表達(dá)作用。（6）同時(shí),重組草魚TGF-β1可以在體外抑制重組草魚IL-1β對(duì)其受體相關(guān)基因（IL-1RI和IL-1RAcP）的誘導(dǎo)表達(dá)作用。相反，重組草魚TGF-β1刺激對(duì)IL-1β信號(hào)具有抑制作用的IL-1RII的表達(dá)，并放大重組草魚IL-1β對(duì)IL-1RII的誘導(dǎo)表達(dá)作用。因此,重組草魚

10、TGF-β1在抑制IL-1β信號(hào)放大相關(guān)基因（IL-1RI和IL-1RAcP）表達(dá)的同時(shí)又能增強(qiáng)IL-1β信號(hào)內(nèi)源天然拮抗劑（IL-1RII）的表達(dá)，從而雙重有利于TGF-β1抑制IL-1β信號(hào)的作用。（7）另一方面，qPCR和WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組草魚IL-1β可以上調(diào)TGF-β1的I型受體（ALK5）的表達(dá)，并能放大重組草魚TGF-β1對(duì)ALK5的誘導(dǎo)表達(dá)作用。此外，重組草魚IL-1β可以增強(qiáng)重組草魚TGF-β1引起的Smad2磷酸化水平

11、，證明IL-1β可以放大TGF-β1的信號(hào)傳導(dǎo)。（8）在嗜水氣單胞菌感染的體內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)重組TGF-β1可以抑制細(xì)菌感染對(duì)草魚IL-1β的誘導(dǎo)表達(dá)作用，證明了重組TGF-β1在體內(nèi)的抑炎癥功能。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明草魚TGF-β1通過影響IL-1β受體相關(guān)基因（IL-1RI、IL-1RAcP和IL-1RII）的表達(dá)和細(xì)胞信號(hào)通路（NFκB）的激活來抑制草魚IL-1β對(duì)自身基因的誘導(dǎo)表達(dá)；反之, IL-1β可以放大TGF-β1的信號(hào)傳導(dǎo)。因此

12、，IL-1β和TGF-β1的相互作用構(gòu)成了草魚IL-1β誘導(dǎo)表達(dá)的負(fù)調(diào)控機(jī)制之一。
　　總之，本論文在明確草魚IL-1β的兩種誘導(dǎo)表達(dá)（炎癥誘導(dǎo)和自我誘導(dǎo)）方式的基礎(chǔ)上，分別揭示了基于內(nèi)源天然拮抗劑（IL-RII）和抑炎癥因子（TGF-β1）負(fù)調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)表達(dá)的方式和原理，從而詮釋了在魚類基于IL-1β信號(hào)引起的炎癥反應(yīng)放大過程中的控制機(jī)制。本論文的發(fā)現(xiàn)不僅揭示了魚類維持免疫穩(wěn)態(tài)的兩種重要分子機(jī)制，而且有利于了解先天性免疫系