煙曲霉菌殼聚糖酶基因與報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、　　本文首先根據(jù)Genbank所發(fā)布的煙曲霉菌殼聚糖酶基因序列人工合成8條DNA長鏈及4條引物鏈。利用PCR拼接法擴(kuò)增殼聚糖酶基因并克隆入pGEM(R)-Teasy載體，進(jìn)行序列分析后，進(jìn)一步亞克隆入pGEX-3X和pTracerTM-CMV/Bsd載體，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-3X-Csn和真核表達(dá)載體pTracer-Csn。重組質(zhì)粒pGEX-3X-Csn轉(zhuǎn)化EcoliDH5α，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析及FactorXa純化消

2、化重組GST-Csn融合蛋白，得到重組Csn純品。降解殼聚糖活性實(shí)驗(yàn)表明，所得重組殼聚糖酶具有降解殼聚糖的生物活性。之后，以C2C12小鼠成肌細(xì)胞為宿主細(xì)胞，分別以脂質(zhì)體和殼聚糖為載體，介導(dǎo)pTracer-Csn質(zhì)粒與含β-半乳糖苷酶報(bào)告基因的質(zhì)粒pTracer-LacZ共同轉(zhuǎn)染，通過測定β-半乳糖苷酶的瞬時(shí)表達(dá)量來反映殼聚糖的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果證實(shí)，將可特異性降解殼聚糖的重組殼聚糖酶的基因轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，降解殼聚糖-DNA復(fù)合物中的殼聚糖載