CYP1A1共轉染報告基因模型的建立及在中藥單體影響CYP1A1基因表達篩選的應用.pdf

1、CYP1A1是CYP450的一種亞型，其轉染活化受到芳香烴受體(AhR)的調控。CYP1A1可氧化代謝多環(huán)芳香類化合物(PAHs)，將其代謝為具有基因毒性的一系列的水溶性衍生物，這些衍生物可以接合到DNA結構中，影響DNA的正常功能，從而誘導腫瘤的發(fā)生。這類化合物中的TCDD(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p dioxin)是目前所知CYP1A1最強的誘導劑。
　　 臨床上，CYP1A1的活化會導致許多不

2、期望發(fā)生的藥物相互作用和毒副反應。因而人們?yōu)榱祟A測和控制CYP1A1的活性，開發(fā)了許多方法用以檢測CYP1A1在外源化合物作用下的活性，并用以發(fā)現(xiàn)CYP1A1的專屬誘導劑或抑制劑。熒光素酶報告基因技術就是這些方法較為先進的一種。其基本原理是將一段需要檢測的基因的調控序列與表達螢火蟲熒光素酶的基因序列接合到一起，然后將這段接合的DNA以質粒的形式導入到細胞中，目標基因的轉錄活性就會以螢火蟲熒光素酶的多少表達出來。報告基因模型相比經典的方法

3、具有無可替代的優(yōu)勢，具有很高的普及性和應用性。
　　 因此，本研究的目的是建立和驗證CYP1A1熒光素酶報告基因模型，并應用于篩選常見中藥，如銀杏，丹參，大黃，白花前胡，紫菀等的有效成分對CYP1A1酶基因表達的影響，為研究及預測藥物相互作用提供依據(jù)。
　　 一、人CYP1A1報告基因模型的建立和驗證。
　　 目的：建立人CYP1A1報告基因模型，為下一步藥物誘導及抑制實驗提供基礎。
　　 方法：采用由德

4、國Tubingen大學Peter A.Munzel教授構建的三種質粒，分別為pT81Luc/hCYP1A1-5_wt，pT81/CDEF及pT81/hCYP1a1_3×DRE。并選擇來源于人肝的HepG2細胞和來源于人小腸的LS174T細胞做為其載體。應用脂質體Lipofectamine2000將質粒轉入細胞。
　　 結果：
　　 1.通過確定細胞的接種量，脂質體的轉染比例，最終確定采用質粒pT81/hCYP1a1_3×

5、DRE建立報告基因模型。
　　 2.采用TCDD做陽性對照，通過篩選不同濃度，最終選用10nM做高通量篩選時的陽性對照的濃度。
　　 結論：本部分采取簡單易行而且高效的方法，通過選擇合適的質粒，考查并優(yōu)化多項指標，成功地在HepG2細胞及LS174T細胞上建立了人CYP1A1報告基因模型。并確定了陽性藥物TCDD進行藥物誘導實驗的最佳濃度，為下一步的篩選實驗提供了可靠的基礎。
　　 二、銀杏葉提取物及其它中藥單體

6、誘導人CYP1A1基因表達的研究。
　　 目的：篩選包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，前胡，桑白皮，紫苑等常見中藥中的單體化合物對CYP1A1基因基礎表達的誘導情況。
　　 方法：采用之前建立的人CYP1A1報告基因模型，在24孔板或48孔板上接種HepG2細胞或LS174T細胞，12h之后轉染pT81/hCYP1a1_3×DRE進細胞，4-6h后按所需的濃度加入待測藥物。孵育48h之后通過報告基因檢測基因表達。
　　

7、 結果：
　　 1.銀杏葉提取物中的三種萜類化合物銀杏內酯A(GA)，銀杏內酯B(GB)及白果內酯(BB)在基于HepG2細胞的模型上，與空白對照組比均可抑制CYP1A1的轉錄活性。三種主要的黃酮類化合物槲皮素(Que)，山萘酚(Kae)，異鼠李素(Iso)則誘導CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，除銀杏內酯B(GB)外均可抑制CYP1A1的轉錄活性。
　　 2.丹參中的六種有效成分丹參酮Ⅰ(Ta

8、nⅠ)，丹參素鈉(SD)，原兒茶醛(Proto)，丹酚酸B(SA-B)，丹參酮ⅡA(TanⅡA)，隱丹參酮(CTan)在基于HepG2細胞的模型上，與空白對照組比均可誘導CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，均可抑制CYP1A1的轉錄活性。
　　 3.大黃中的大黃素甲醚(Phy)，大黃酸(Rhe)，大黃酚(Chr)在基于HepG2細胞的模型上，均可誘導CYP1A1的轉錄活性。大黃素(Emo)和蘆薈大黃素(Al

9、o)則可抑制CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，則均可抑制CYP1A1的轉錄活性。
　　 4.白花前胡中的四種有效成分在基于HepG2細胞的模型上，除白花前胡素E(PraE)外，白花前胡甲素(PraA)，白花前胡丙素(PraC)，白花前胡丁素(PraD)均可誘導CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，除白花前胡甲素(PraA)外均可抑制CYP1A1的轉錄活性。
　　 5.紫苑中的兩

10、種有效成分紫苑酮(Shi)和表木栓醇(Epi)，以及桑色素(Mor)，桑皮苷A(Mul)，白藜蘆醇(Resveratrol)在基于HepG2細胞的模型上，除桑皮苷A(Mul)外均可誘導CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，除桑色素(Mor)外均可抑制CYP1A1的轉錄活性。
　　 6.白藜蘆醇(Resveratrol)在給予梯度濃度0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM的情況下，除0.01μM

11、，0.1μM兩個給藥組產生了抑制作用，其它三個給藥組1μM，10μM，100μM都產生了誘導作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。
　　 結論：本部分研究通過之前建立的人CYP1A1報告基因模型，篩選了包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，白花前胡，紫苑等常見中藥中的主要單體，以及桑皮苷A，桑色素，白藜蘆醇等，總共25個中藥單體化合物。結果表明這些化合物普遍存在誘導或抑制人CYP1A1基因表達的作用。其中誘導作用中較為顯著的結果有白藜蘆醇(Re

12、sveratrol)使轉錄活性升高到3.60倍。對白藜蘆醇不同濃度的篩選表明白其誘導作用呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　 三、銀杏葉提取物及其它中藥單體抑制人CYP1A1基因表達的研究。
　　 目的：在CYP1A1基因處于誘導高表達的基礎上，篩選包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，前胡，桑白皮，紫苑等常見中藥中的各單體化合物對CYP1A1基因表達的抑制情況。
　　 方法：采用之前建立的人CYP1A1報告基因模型，在24孔板或48

13、孔板上接種HepG2細胞或LS174T細胞，12h之后轉染pT81/hCYP1a1_3×DRE進細胞，4-6h后按所需的濃度加入待測藥物。孵育48h之后通過報告基因檢測基因表達。
　　 結果：
　　 1.銀杏葉提取物中的槲皮素(Que)，山萘酚(Kae)，異鼠李素(Iso)和白果內酯(BB)在基于HepG2細胞的模型上，可提高CYP1A1的轉錄活性。而銀杏內酯A(GA)和銀杏內酯B(GB)可降低CYP1A1的轉錄活性。而

14、在基于LS174T細胞的模型上，除槲皮素(Que)和銀杏內酯A(GA)外，均可提高CYP1A1的轉錄活性。
　　 2.丹參中除丹參素鈉(SD)和隱丹參酮(CTan)外，在基于HepG2細胞的模型上，丹參酮Ⅰ(TanⅠ)，原兒茶醛(Proto)，丹酚酸B(SA-B)，丹參酮ⅡA(TanⅡA)均可明顯提高CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，除丹參酮Ⅰ(TanⅠ)和隱丹參酮(CTan)外，均可提高CYP1A1的轉

15、錄活性。
　　 3.大黃中的大黃素(Emo)，大黃酚(Chr)，大黃素甲醚(Phy)，大黃酸(Rhe)，蘆薈大黃素(Alo)在基于HepG2細胞的模型上，均可降低CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，除大黃素(Emo)外，均可提高CYP1A1的轉錄活性。
　　 4.白花前胡中的白花前胡甲素(PraA)，白花前胡丙素(PraC)，白花前胡丁素(PraD)，白花前胡素E(PraE)在基于HepG2細胞的模

16、型上，均可降低CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，均可提高CYP1A1的轉錄活性。
　　 5.紫苑中的兩種有效成分紫苑酮(Shi)和表木栓醇(Epi)，以及桑色素(Mor)，桑皮苷A(Mul)，白藜蘆醇(Resveratrol)在基于HepG2細胞的模型上，除桑皮苷A(Mul)和紫苑酮(Shi)外均可提升CYP1A1的轉錄活性。而在基于LS174T細胞的模型上，均可提升CYP1A1的轉錄活性。
　　

17、 6.大黃素(Emo)在給予梯度濃度0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM的情況下，除0.1μM，1μM兩個給藥組產生了抑制作用，其它三個給藥組0.01μM，10μM，100μM都產生了誘導作用，并且在1μM以上的濃度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。
　　 結論：本部分研究在前一部分的基礎之上，篩選了包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，白花前胡，紫苑等常見中藥中的主要單體，以及桑皮苷A，桑色素，白藜蘆醇等，總共25個中藥單體化合

18、物對誘導高表達的CYP1A1的基因表達活性的作用。結果表明大部分化合物都能抑制處于高表達狀態(tài)的人CYP1A1基因轉錄活性。其中較為顯著的結果有大黃素(Emo)使CYP1A1的轉錄活性降低約70％。
　　 綜上所述，本研究建立了適合于高通量篩選的人CYP1A1報告基因方法，篩選和研究了包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，前胡，桑白皮，紫苑等常見中藥中的共25個中藥單體化合物，對CYP1A1酶基因基礎表達和高表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對