殼聚糖納米粒子介導(dǎo)Ⅲ型NaPi共轉(zhuǎn)運(yùn)子基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性研究.pdf

1、繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)(SecondaryhyperparathyroidismSHPT)是慢性腎功能衰竭(chronicalrenalfailureCRF)的重要并發(fā)癥，高磷血癥是刺激CRF患者甲狀旁腺素(parathyroidhormone，PTH)分泌的重要因素，但其分子發(fā)病機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)已證實(shí)PTH是尿毒癥患者體內(nèi)重要的毒素之一，且用常規(guī)的透析方法不能清除，它在體內(nèi)的蓄積可引起一系列遠(yuǎn)期并發(fā)癥，如腎性骨病、骨髓纖維化、頑固性心

2、力衰竭及心律失常，動(dòng)脈血管壁纖維化、鈣化，血管舒縮功能障礙，表現(xiàn)為難以糾正地嚴(yán)重高血壓和低血壓；體內(nèi)免疫系統(tǒng)功能紊亂，患者易發(fā)生反復(fù)、多部位難以控制的感染及運(yùn)動(dòng)和植物神經(jīng)的功能異常等，這些并發(fā)癥已逐漸成為影響患者生活質(zhì)量及生存時(shí)間的重要原因。由于這些并發(fā)癥的發(fā)病率及死亡率高，對(duì)發(fā)病機(jī)制的了解及尋找有效地治療對(duì)策就倍受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，是目前研究的熱點(diǎn)之一。 1937年TrumanG.Drake等學(xué)者對(duì)兔的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了磷是導(dǎo)致腎

3、功能不全甲狀旁腺細(xì)胞增殖(hyperplasia)的原因之一的假設(shè)。以后許多研究顯示在腎功能衰竭繼發(fā)甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)的發(fā)生發(fā)展中細(xì)胞外磷的濃度起了重要調(diào)節(jié)作用，但對(duì)高磷如何引起SHPT的作用機(jī)制的研究目前尚不夠十分深入。有研究證明當(dāng)CRF早期(氮質(zhì)血癥期)由于體內(nèi)低鈣、高磷及酸堿代謝紊亂，其甲狀旁腺PTH分泌功能既行增加，而致終末期腎功能衰竭時(shí)幾乎100％的患者存在SHPT現(xiàn)象，此時(shí)血清PTH水平即不斷升高。 臨床及動(dòng)物研究證明

4、：磷對(duì)PTH的影響是獨(dú)立于血清鈣和1.25(OH)2D3的因素，磷是PTH分泌增加的重要刺激因子。給正常個(gè)體口服高磷(1g)制劑，可導(dǎo)致血磷增加、血離子鈣下降和血PTH的水平上升，持續(xù)高磷飲食可導(dǎo)致腎小球率過(guò)濾下降和腎功能惡化，且當(dāng)GFR下降到25ml/min時(shí)，大部分患者均出現(xiàn)明顯的高磷血癥；實(shí)驗(yàn)大鼠腎功能不全6個(gè)月后既存在明顯的SHPT，此時(shí)將飲食中的含磷量每?jī)芍軠p少一次，從0.9％降至0.3％(同時(shí)飲食中含鈣量從1.6％降至0.6

5、％，以防止高鈣血癥)，此時(shí)血清1.25(OH)2D3水平無(wú)明顯變化，血PTH水平卻顯著降低，但對(duì)血清鈣和1.25(OH)2D3水平影響不大。 基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：高磷血癥可刺激甲狀旁腺細(xì)胞組織增殖，PTH分泌增加。正常生理狀態(tài)下甲狀旁腺細(xì)胞分裂較少，大部分維持在G0期，但尿毒癥時(shí)高磷、低鈣是細(xì)胞有絲分裂的潛在刺激物。在甲狀旁腺增殖中原癌基因c-fos,c-jun等表達(dá)水平明顯升高。此外，在進(jìn)行尿毒癥血清刺激大鼠腎臟細(xì)膜細(xì)胞增殖的研究中

6、觀察到，PTH與腎功能進(jìn)一步惡化，慢性腎臟疾病病變的進(jìn)展明顯相關(guān)。尿毒癥患者由于磷的排泄減少，可進(jìn)一步加重高磷血癥的發(fā)生，引起一系列的臨床并發(fā)癥。 新近發(fā)現(xiàn)的鈉磷共轉(zhuǎn)運(yùn)子(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)是負(fù)責(zé)細(xì)胞攝取細(xì)胞外磷的跨膜蛋白，生理狀況下，其轉(zhuǎn)運(yùn)活性與磷、PTH調(diào)控關(guān)系密切，其中NaPi-Ⅰ最初從非洲蟾蜍屬的卵母細(xì)胞上獲得負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)磷的表達(dá)活性；NaPi-Ⅱ是腎近端小管完成重吸收磷的主要轉(zhuǎn)運(yùn)子，而NaPi-Ⅲ(pit-1)存在于人和大鼠甲

7、狀旁腺細(xì)胞膜上，參與對(duì)磷的攝取。但在SHPT病理狀態(tài)下，NaPi-Ⅲ對(duì)甲狀旁腺細(xì)胞內(nèi)PTH及磷調(diào)控變化的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。 本研究采用小分子RNA干擾技術(shù)(RNAi)抑制NaPi-Ⅲ轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)，殼聚糖納米粒作為RNA基因?qū)胼d體介導(dǎo)NaPi-ⅢsiRNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。殼聚糖是具有生物相容性和可生物降解的新型醫(yī)用生物材料，具有無(wú)刺激、無(wú)致敏、無(wú)溶血、無(wú)致突變、無(wú)抗原性、無(wú)熱原等作用已為實(shí)踐所證明，殼聚糖及其衍生物能與RN

8、A形成聚電解質(zhì)聚合物，將是一種具有持久安全性和高效的陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)移運(yùn)輸載體。殼聚糖與磁性納米載體等其他納米載體相比較具有很好的生物相容性、可被體內(nèi)多種酶類降解、降解產(chǎn)物安全無(wú)毒，并能被生物體完全吸收；對(duì)于基因治療，納米粒還有其他優(yōu)點(diǎn)，納米粒不僅包含穩(wěn)定的基因片段，防止基因的不穩(wěn)定性，還能夠同時(shí)包合某些導(dǎo)靶片斷及其他輔助成分，提高靶向性，提高基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的穿透性或者提高由于刺激受體產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)吞作用等，更有利于抑制NaPi-Ⅲ的表

9、達(dá)，從而提高治療慢性腎衰繼發(fā)性甲旁亢的療效。 本研究由四部分組成： 一、高磷飲食+5/6腎切除制備慢性腎衰竭繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)大鼠模型目的構(gòu)建慢性腎衰竭繼發(fā)甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)大鼠模型，為研究腎性甲旁亢的發(fā)病機(jī)制及治療奠定基礎(chǔ)。方法選取36只8～10周齡SD大鼠，體重在200～250g。隨機(jī)分為6組，每組6只：5/6腎切除高磷飼料組(STNx+HP)；5/6腎切除低磷飼料組(STNx+LP)；5/6腎切除正常磷飼料組(ST

10、Nx+NP)；假手術(shù)高磷飼料組(Sham+HP)；假手術(shù)低磷飼料組(Sham+LP)；假手術(shù)正常磷飼料組(Sham+NP)。造模組予大鼠高磷飲食同時(shí)行大鼠5/6腎切除，大鼠手術(shù)前一周及手術(shù)后7d、14d、21d分別在大鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，分別檢測(cè)大鼠血清中離子鈣(iCa)，血磷(Pi)，全段甲狀旁腺索(iPTH)，血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，尿磷酸鹽排泄分?jǐn)?shù)(FEp)。術(shù)后4w取大鼠殘余腎臟及甲狀腺與甲狀旁腺的復(fù)合體，進(jìn)行病理組織

11、學(xué)檢查。 二、人和大鼠的甲狀旁腺原代細(xì)胞培養(yǎng) 目的培養(yǎng)人和大鼠的甲狀旁腺細(xì)胞。方法甲狀旁腺組織取于慢性腎衰竭繼發(fā)甲旁亢內(nèi)科治療無(wú)效而行外科甲狀旁腺部分切除術(shù)的患者，以及造模成功的腎性甲旁亢的大鼠，參考Leboff試驗(yàn)和方法進(jìn)行甲狀旁腺細(xì)胞原代培養(yǎng)。 殼聚糖納米粒子介導(dǎo)Ⅲ型NaPi共轉(zhuǎn)運(yùn)子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293 目的殼聚糖納米粒子介導(dǎo)Ⅲ型NaPi共轉(zhuǎn)運(yùn)子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293，觀察殼聚糖納米

12、粒子對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK293的轉(zhuǎn)染效率。方法按照Lipofectamine2000(Invitrogen)操作說(shuō)明將NaPi-ⅢsiRNA以及將NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒分別轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NaPi-Ⅲ蛋白含量，ELISA檢測(cè)NaPi-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果經(jīng)熒光素標(biāo)記的NaPi-ⅢsiRNA被轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)較亮的綠色熒光，發(fā)光點(diǎn)數(shù)目較少，

13、而NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)較亮的綠色熒光發(fā)光點(diǎn)數(shù)目較多(見(jiàn)圖4-2、4-3)。根據(jù)轉(zhuǎn)染率=相對(duì)轉(zhuǎn)染率/標(biāo)記效率可知，NaPi-ⅢsiRNA轉(zhuǎn)染率為41.9％，NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染率為58.3％。westernBlotting檢測(cè)NaPi-ⅢsiRNA和NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞后，NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293