Nosema屬微孢子蟲(chóng)基因組特異共線性區(qū)域的進(jìn)化與功能分析.pdf

1、DNA作為遺傳物質(zhì)在承載著生命延續(xù)的同時(shí)也為分子考古學(xué)家研究人類的起源、物種的進(jìn)化史提供了新的契機(jī)。近年來(lái)，隨著基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富和完善，生物學(xué)家逐漸發(fā)現(xiàn)接近1/3的物種都具有物種特異基因，鑒于它們大多是隨機(jī)產(chǎn)生和自然選擇雙重壓力下被保留下來(lái)的“化石”基因，對(duì)物種的環(huán)境適應(yīng)性、自然習(xí)性起著很關(guān)鍵的作用，有的甚至在人腦和視覺(jué)蛋白形成過(guò)程中扮演舉足輕重的作用，因此逐漸受到遺傳學(xué)家和分子考古學(xué)家的青睞。
　　 微孢子蟲(chóng)做為一種存在廣泛

2、宿主的“無(wú)線粒體”原生動(dòng)物，它們兼具原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的特征，盡管對(duì)于它們的進(jìn)化地位仍然存在爭(zhēng)議，但是近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明它們是進(jìn)化地位較低的真核生物，并且目前已被NCBI歸類為真菌類。其中家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosemabombycis）作為首個(gè)被鑒定的微孢子蟲(chóng)，專性寄生于經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)家蠶，是引發(fā)家蠶微粒子病的病原體。家蠶微孢子蟲(chóng)能夠在外晃環(huán)境刺激下，成功彈出極絲，將孢原質(zhì)送入宿主體內(nèi)從而成功的寄生，進(jìn)而引起家蠶生理機(jī)能障礙，造成宿主細(xì)胞

3、的病變壞死以及組織器官功能的喪失。鑒于其對(duì)人類經(jīng)濟(jì)生活帶來(lái)的巨大危害，目前，家蠶微孢子蟲(chóng)已被世界各養(yǎng)蠶國(guó)家和地區(qū)列為唯一法定檢疫對(duì)象。盡管對(duì)其研究已有近150年的歷史，但是微粒子病的防控仍然是蠶業(yè)界研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著基因組時(shí)代的來(lái)臨，人們獲得了越來(lái)越多的微孢子蟲(chóng)基因組序列信息，因此，基于比較基因組學(xué)分析，探索不同種屬之間的微孢子蟲(chóng)的差異基因的種類、數(shù)量及功能，對(duì)于研究不同種類微孢子蟲(chóng)生物學(xué)特征，發(fā)掘微孢子蟲(chóng)與其對(duì)應(yīng)宿主之間的共進(jìn)化關(guān)

4、系，以及為尋找種屬特異的檢測(cè)靶標(biāo)基因，具有十分重要的生物學(xué)意義。近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)進(jìn)行了全基因組框架圖的繪制，基于全基因組序列的數(shù)據(jù)，并結(jié)合已報(bào)道的其他微孢子蟲(chóng)基因組，我們首次鑒定到一段Nosema屬特有的基因組區(qū)域，為哺乳動(dòng)物寄生性微孢子蟲(chóng)——兔腦炎微孢子蟲(chóng)、腸道微孢子蟲(chóng)和比氏腸道微孢子蟲(chóng)基因組所缺失。這段Nosema屬微孢子蟲(chóng)基因組共線性區(qū)域的演化歷程是怎樣的？分布于該基因組特異區(qū)域內(nèi)的編碼基因在家蠶微孢子蟲(chóng)基因組中扮演

5、什么樣的角色？鑒于物種特異基因在研究微孢子蟲(chóng)進(jìn)化史以及不同微孢子蟲(chóng)間的分子鑒定兩方面的重要性，同時(shí)也為了回答上述問(wèn)題，本論文的主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1.Nosema屬微孢子蟲(chóng)特異基因組共線性區(qū)域的鑒定與分析
　　 對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)、兔腦炎微孢子蟲(chóng)和蜜蜂微孢子蟲(chóng)的同源基因進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲(chóng)第32號(hào)Scaffold上存在一段Nosema屬特異的基因組區(qū)域，進(jìn)而在已發(fā)布基因座位信息的六種微孢子蟲(chóng)中進(jìn)行基因座位保守

6、性分析，進(jìn)一步證實(shí)該區(qū)域?yàn)槟X炎屬微孢子蟲(chóng)及比氏腸道微孢子蟲(chóng)基因所丟失的基因組片段。通過(guò)對(duì)其中分布的編碼基因的預(yù)測(cè)及分析，發(fā)現(xiàn)這段特異的基因組區(qū)域存在兩個(gè)編碼序列，基因代號(hào)為NBO32g0034和NBO32g0035，前者編碼DNA聚合酶kappa（簡(jiǎn)稱NbPolκ），后者NBO32g0035的預(yù)測(cè)功能未知（簡(jiǎn)稱NbOP1），RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩個(gè)基因均能夠正常轉(zhuǎn)錄。對(duì)該區(qū)域上游970bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子和調(diào)控元件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在保

7、守的TATA框和GC框結(jié)構(gòu)，并且含有SP1結(jié)合位點(diǎn)、CAP/CRP結(jié)合位點(diǎn)、bZIP(Basci-leucinezipper)轉(zhuǎn)錄因子蛋白、Tst-1結(jié)合位點(diǎn)和c-Myb等參與轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的調(diào)控基礎(chǔ)序。該區(qū)域的GC含量明顯大于N.bombycis基因組的平均GC含量，并且大量分布DNA類型的轉(zhuǎn)座元件，暗示該區(qū)域是基因組不穩(wěn)定區(qū)域。
　　 2.NbPolκ和NbOP1蛋白的編碼基因序列特征及其染色體定位研究
　　 為了深入

8、了解分布于該段特異基因組區(qū)域內(nèi)的編碼基因特征，我們首先針對(duì)NbOP1的編碼基因進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，結(jié)果顯示該蛋白在家蠶微孢子蟲(chóng)基因組中不存在其他拷貝，其序列不具有信號(hào)肽，僅含有4個(gè)疏水簇，并且富含極性氨基酸，隨后對(duì)該位置蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其包含20個(gè)α螺旋和11個(gè)β折疊。經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)該基因具有核苷酸多態(tài)性，屬于典型的孤兒蛋白。
　　 隨后，我們對(duì)NbPolκ蛋白的編碼基因進(jìn)行了生物信息分析，確定其D87至L417存在保

9、守的DNA聚合酶kappa功能結(jié)構(gòu)域，但比典型的真核生物POLK存在N-端和C-端的減縮，但是，這種兩端不同程度的缺失并沒(méi)有影響其氨基酸的結(jié)構(gòu)特征。而用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示NbPolκ與其他三種微孢子蟲(chóng)的POLK聚為一簇，但是這一簇基因卻與真菌界的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而是落入了細(xì)菌域，并與梭狀芽孢桿菌(Clostridia)親緣關(guān)系較近。該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)在一定程度上反映了NbPolκ的進(jìn)化歷程，推測(cè)NbPolκ可能水平轉(zhuǎn)移自某一種細(xì)

10、菌。
　　 通過(guò)對(duì)NbPolκ和NbOP1的同源信息檢索，并制備探針進(jìn)行Southernblot雜交，結(jié)果說(shuō)明我們所分析的具有Nosema屬微孢子蟲(chóng)基因組共線性區(qū)域位于家蠶微孢子蟲(chóng)的第XV染色體上。
　　 3.NbPolκ和NbOP1的在釀酒酵母中的定位
　　 首先采用亞細(xì)胞定位導(dǎo)肽預(yù)測(cè)軟件對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示NbPolκ可能分布于細(xì)胞核或者線粒體中，而NbOP1則具有細(xì)胞質(zhì)定位特征。隨后利用

11、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，檢測(cè)其各自的亞細(xì)胞定位分布。結(jié)果表明，NbOP1定位于釀酒酵母的細(xì)胞質(zhì);而NbPolκ則能夠靶向釀酒酵母線粒體，并且N-端導(dǎo)肽序列對(duì)于NbPolκ的定位信號(hào)沒(méi)有任何影響。這一結(jié)果與克魯斯錐蟲(chóng)的同源基因TcPolκ能夠具有線粒體定位信號(hào)的特征相符合，暗示寄生生活中的NbPolκ的特殊地演化地位及其與典型真核生物Polκ的功能分化。
　　 4.NbPolκ和NbOP1在家蠶微孢子蟲(chóng)基因組中的功能驗(yàn)證
　　

12、為了更好的了解這兩個(gè)編碼基因在家蠶微孢子蟲(chóng)基因組的表達(dá)定位特征以及其可能存在的功能。我們構(gòu)建了原核表達(dá)載體，通過(guò)重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，獲得了與理論分子量一致的重組蛋白，用其免疫小鼠以制備多克隆抗體。免疫印跡結(jié)果顯示所得抗血清特異性較好，能夠識(shí)別與理論分子量相近的蛋白條帶。分別用其與成熟孢子和處于增殖期的孢子進(jìn)行間接免疫熒光，表明NbOP1為一種新鑒定到的位于家蠶微孢子蟲(chóng)孢壁的蛋白;而NbPolκ則是定位于家蠶微孢子蟲(chóng)細(xì)胞核的參與

13、氧化損傷途徑的蛋白。
　　 5.Nosema屬微孢子蟲(chóng)基因組特異共線性區(qū)域的進(jìn)化歷程假說(shuō)
　　 根據(jù)我們前面對(duì)兩個(gè)編碼基因的研究，結(jié)合微孢子蟲(chóng)的物種進(jìn)化分析，我們通過(guò)總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并提出了該片段在微孢子蟲(chóng)基因組中進(jìn)化歷程的假說(shuō)。假說(shuō)核心為，微孢子蟲(chóng)的最近共同祖先(LastCommonAncester,LCA)通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移或垂直遺傳獲得Nosema屬微孢子蟲(chóng)基因組特異共線性區(qū)域，之后，該區(qū)域在微粒子屬與腦炎屬微孢子蟲(chóng)在物

14、種分化之后各自獨(dú)立進(jìn)化。，NbPolκ的保留可能是為了應(yīng)對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)和蜜蜂微孢子蟲(chóng)來(lái)自昆蟲(chóng)宿主的劇烈地氧化應(yīng)激（酚氧化物酶通路）的攻擊所造成的DNA損傷，但是可能由于功能退化或者功能分化進(jìn)而NbPolκ僅保留在四種感染昆蟲(chóng)的微孢子蟲(chóng)的基因組中中然而，家蠶微孢子蟲(chóng)物種特異基因NbOP1的保留是由于家蠶微孢子蟲(chóng)宿主專性適應(yīng)性需要而衍生出的新的功能基因。當(dāng)然，這些推論亟待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 綜上所述，本研究首次對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)物

15、種特異基因進(jìn)行細(xì)致的研究，并同其他微孢子蟲(chóng)的基因座位保守性進(jìn)行了比較研究，證實(shí)這段Nosema屬微孢子蟲(chóng)基因組特異共線性區(qū)域中的兩個(gè)功能基因均能夠編碼家蠶微孢子蟲(chóng)生理代謝途徑不可或缺的重要蛋白。最后，結(jié)合前期的分析數(shù)據(jù)我們對(duì)該區(qū)域的成因進(jìn)行了初步探討，并提出微孢子蟲(chóng)中差異基因序列的形成機(jī)制的假說(shuō)?？傊?，本研究初步探索了家蠶微孢子蟲(chóng)專性細(xì)胞內(nèi)寄生生活所形成的寄生蟲(chóng)與宿主協(xié)同進(jìn)化歷程，同時(shí)，也為篩選家蠶微粒子病的分子檢測(cè)靶標(biāo)基因奠定分子生物