登革病毒非編碼3’亞基因組RNA的鑒定與功能分析.pdf

1、登革病毒(dengue virus,DV)是重要的蟲(chóng)媒黃病毒(Flavivirus),能引起人類(lèi)的登革熱和登革出血熱。目前尚無(wú)有效的登革疫苗和抗病毒藥物。登革病毒基因組為一條單股正鏈RNA分子,可作為信使RNA直接起始翻譯,并通過(guò)其中僅有的一條長(zhǎng)讀碼框(open reading frame,ORF)編碼病毒所有的十種特異蛋白。病毒基因組RNA(genomic RNA,gRNA)亦可作為模板指導(dǎo)子代gRNA的合成,該過(guò)程遵循“gRNA——

2、gRNA互補(bǔ)負(fù)鏈——子代gRNA”的模式。由此可見(jiàn),登革病毒基因組的表達(dá)和復(fù)制都圍繞著一條gRNA分子進(jìn)行。因而通常認(rèn)為登革病毒并不產(chǎn)生亞基因組RNA分子(sub-genomic RNA,sgRNA)。
　　登革病毒基因組的表達(dá)和復(fù)制受一系列基因組順式作用元件(cis-acting element)和反式激活因子(trans-activator)的調(diào)控。登革病毒的順式調(diào)控元件主要位于gRNA5’和3’端上的非編碼區(qū)(non-cod

3、ing region),其中包含了多個(gè)高度保守的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些RNA結(jié)構(gòu)元件能夠特異性地識(shí)別病毒復(fù)制的反式激活因子,從而對(duì)病毒gRNA的翻譯和復(fù)制過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。根據(jù)病毒基因組結(jié)構(gòu)特征,通常認(rèn)為,5’NCR的功能與gRNA的翻譯有關(guān)。而3’NCR負(fù)責(zé)調(diào)控gRNA的復(fù)制。通過(guò)前期的研究,我們發(fā)現(xiàn)3’NCR中還存在翻譯增強(qiáng)元件(Translation enhancement element,TE)。囿于現(xiàn)有的登革病毒復(fù)制模型,還不能完滿

4、地解釋上述矛盾,推測(cè)在病毒基因組的復(fù)制過(guò)程中還存在其它調(diào)控機(jī)制。
　　從進(jìn)化上看,單正鏈RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征與其采取的基因組復(fù)制調(diào)控策略存在密切的關(guān)系。值得注意是,一些單正鏈的RNA病毒雖然在基因組結(jié)構(gòu)上與登革病毒近似,但在復(fù)制上還需要產(chǎn)生源于病毒基因組3’末端的亞基因組RNA分子(3’sub-genomic RNA,3’sgRNA)。利用這類(lèi)3’sgRNA分子,病毒既可增強(qiáng)基因組3’末端基因的表達(dá),或進(jìn)一步對(duì)自身復(fù)制進(jìn)行調(diào)

5、控。但對(duì)登革病毒,目前尚無(wú)相關(guān)的研究。因此,倘若登革病毒在復(fù)制過(guò)程中確實(shí)存在類(lèi)似的3’sgRNA分子,這無(wú)疑對(duì)闡明登革病毒復(fù)制調(diào)控策略具有重要的意義,并為研究登革病毒復(fù)制的分子機(jī)制提供新的思路。
　　為此,本研究通過(guò)Northern雜交方法對(duì)登革病毒感染的細(xì)胞和組織總RNA進(jìn)行了鑒定。首先根據(jù)登革四個(gè)血清型病毒基因組3’NCR序列比對(duì)結(jié)果,選定基因組3’最末端的高度保守序列作為雜交探針的靶點(diǎn),利用體外轉(zhuǎn)錄方法制備獲得地高辛標(biāo)記的探

6、針RNA分子。初步的雜交結(jié)果證實(shí)登革病毒在復(fù)制過(guò)程中確能產(chǎn)生一類(lèi)源于基因組3’末端的亞基因組RNA分子(3’sgRNA)。進(jìn)一步的雜交結(jié)果表明,從登革四個(gè)血清型病毒所感染的BHK-21細(xì)胞與乳鼠腦組織中均可檢出該類(lèi)3’sgRNA分子,表明它的產(chǎn)生是登革病毒復(fù)制中的普遍現(xiàn)象。同時(shí)還觀察到登革2型中的一株病毒(DV2-43)能同時(shí)產(chǎn)生三條3’sgRNA分子的株特異性現(xiàn)象。在病毒感染后的不同時(shí)間點(diǎn)上,隨著病毒gRNA復(fù)制增多,3’sgRNA在

7、宿主細(xì)胞中也不斷累積。這一現(xiàn)象提示3’sgRNA的產(chǎn)生很可能與病毒復(fù)制有關(guān)。此外,在不同組織來(lái)源的宿主細(xì)胞中,病毒3’sgRNA的生成量存在明顯的差異。這提示了3’sgRNA的產(chǎn)生還與宿主因素存在某種關(guān)聯(lián)。上述結(jié)果為闡明登革病毒3’sgRNA的產(chǎn)生機(jī)制和潛在的生物學(xué)功能提供了重要的線索。
　　在此基礎(chǔ)上,為明確登革病毒3’sgRNA產(chǎn)生的緣由,本研究利用5’RACE法獲得了登革病毒3’sgRNA的序列信息。比對(duì)結(jié)果顯示登革病毒3’

8、sgRNA的5’端起始于病毒基因組3’NCR的內(nèi)部,這表明3’sgRNA實(shí)質(zhì)上是游離形式的3’NCR分子。3’sgRNA的5’起始序列高度保守,且能形成一個(gè)穩(wěn)定的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)SL,提示該段序列可能具有啟動(dòng)子樣功能。RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)還表明,保守序列與SL結(jié)構(gòu)的莖部序列恰好吻合,說(shuō)明3’sgRNA的產(chǎn)生與SL結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)。在細(xì)胞5’核酸外切酶XRN-1的作用下,SL結(jié)構(gòu)的存在可使病毒gRNA及其模擬物VIRG分子經(jīng)部分降解產(chǎn)生與3’sgR

9、NA類(lèi)似的RNA片段。另一方面,Western blotting結(jié)果表明,XRN-1可被BHK-21等真核細(xì)胞表達(dá)。上述結(jié)果初步表明 XRN-1參與了登革病毒3’sgRNA在細(xì)胞內(nèi)的生成。我們認(rèn)為3’sgRNA的產(chǎn)生是RNA結(jié)構(gòu)與宿主核酸酶類(lèi)相互作用的結(jié)果,這為從分子機(jī)制上干擾3’sgRNA的產(chǎn)生提供了可能的靶點(diǎn),并為揭示該分子的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　為進(jìn)一步探明3’sgRNA的生物學(xué)功能,本研究通過(guò)將3’sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

10、的方法,對(duì)3’sgRNA在病毒基因組翻譯和復(fù)制中的作用進(jìn)行的鑒定。我們首先利用病毒小基因組VIRG對(duì)登革病毒gRNA的翻譯起始過(guò)程進(jìn)行了模擬,從中觀察到3’sgRNA的轉(zhuǎn)染能下調(diào)VIRG報(bào)告基因的表達(dá)量。而對(duì)病毒基因組RNA的定量分析結(jié)果表明,預(yù)先轉(zhuǎn)染3μg的3’sgRNA轉(zhuǎn)錄體,可使105個(gè)細(xì)胞中的病毒基因組RNA拷貝數(shù)上升一個(gè)數(shù)量級(jí),并且3’sgRNA轉(zhuǎn)染量與其對(duì)復(fù)制的增強(qiáng)作用間存在依賴性關(guān)系。登革病毒在3’sgRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上能

11、形成更多的病毒蝕斑,說(shuō)明3’sgRNA不僅對(duì)gRNA翻譯和復(fù)制起調(diào)節(jié)作用,它的存在也有利于病毒的增殖。為明確3’sgRNA的作用機(jī)制,本研究對(duì)3’sgRNA包含的基因組環(huán)化序列進(jìn)行了突變,以求破壞3’sgRNA與病毒基因組5’端的互補(bǔ)結(jié)合。結(jié)果表明,突變可削弱3’sgRNA對(duì)病毒復(fù)制的增強(qiáng)作用,這說(shuō)明3’sgRNA的調(diào)節(jié)作用依賴環(huán)化序列介導(dǎo)的RNA-RNA相互作用。由此我們認(rèn)為登革病毒3’sgRNA是一種通過(guò)反式作用對(duì)病毒復(fù)制進(jìn)行調(diào)節(jié)的