單純皰疹病毒（HSV-2）包膜糖蛋白gG-2的克隆表達產(chǎn)物的純化及其診斷試劑盒的制備.pdf

1、單純皰疹病毒(HSV)可分為HSV-1和HSV-2兩種血型。HSV-2型可引起生殖器皰疹、新生兒皰疹等，其中新生兒皰疹的病死率高達60％，孕婦感染后是造成嬰兒先天畸形的主要病原體，同時對孕婦也可引起嚴重病變，如壞死性肝炎等，病死率達50％，也是器官移植及AIDS病人并發(fā)感染死亡的常見原因之一。并認為與宮頸癌的發(fā)生有關。因此感染HSV的早期診斷及分型具有重要意義。 目前國內(nèi)外單皰疹病毒分型方法大概有PCR直接分型、單克隆抗體法、免

2、疫學檢測。由于PCR檢測操作過程的高要求和易出現(xiàn)假陽性；單克隆抗體分型法有較大的實用性，但有時表現(xiàn)為不完全特異性；核酸探針技術操作煩瑣，造價高，應用受限；免疫血清學中的ELISA法，簡便快速、靈敏度高、價格低廉、。國內(nèi)用于檢測用抗原大多還依賴進口，尋求一種特異性高，純度高，價格低廉的抗原具有現(xiàn)實意義。 隨著基因工程技術的發(fā)展，基因工程抗原逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗原廣泛的應用于各種檢測，基因工程抗原結構單純，性質穩(wěn)定，特異性高。

3、目的:該項研究的主要目的是用基因工程方法表達HSV-Ⅱ血清型特異性抗原，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒檢測抗原制備試劑盒，以提高檢測的特異性，敏感性，降低檢測成本，促進病毒檢測的發(fā)展。 方法:根據(jù)genebank所查的HSV-2gG-2基因和相關文獻選取特異片斷，設計引物，用PCR方法調(diào)取基因，將PCR產(chǎn)物切膠回收后與pET-30a載體連接，轉化DH5α，篩選。對陽性菌落測序后，將帶有目的基因的質粒轉入BL21菌株，經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-

4、PAGE檢測蛋白的表達，用westen方法鑒定蛋白抗原性，用交叉連續(xù)稀釋分析法滴定抗原滴度，然后包被酶標板制作試劑盒，與傳統(tǒng)HSV-Ⅱ、HSV-Ⅰ抗原制作的試劑盒、PCR試劑盒比較其陽性符合率，陰性符合率，其敏感性，特異性為。將試劑盒放置不同溫度條件(4℃、37℃、室溫)不同時間(6月、10d、3月)后，與新鮮制作的試劑盒比較研究了試劑盒的穩(wěn)定性。并初步應用于臨床性病患者的標本檢測。 結果:1、工程菌表達的目的蛋白具有預期抗原活

5、性;2、用純化基因工程抗原包被酶標板制備了IgM檢測試劑盒;3、用基因工程抗原制作的試劑盒與傳統(tǒng)試劑盒比較，其陽性符合率為70％，陰性符合率為96.7％。表明基因工程抗原制作的試劑盒特異性高，敏感性強。與PCR試劑盒比陽性符合率為83.3％，陰性符合率為86.7％，有較高的符合率，且假陽性率低。表明基因工程抗原試劑盒的可行性。穩(wěn)定性試驗結果，表明所建立的試劑盒穩(wěn)定可靠，易于4℃長期存放、相對較高溫度的短期存放(如運輸?shù)?，利于推廣使用;