加味澤瀉湯對(duì)NAFLD小鼠腸道微生物干預(yù)作用的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外酒精和其他明確的損肝因素所致的脂肪在肝臟堆積所產(chǎn)生的以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪性變?yōu)橹饕∽兊呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝(SFL)、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。該病在全球及中國(guó)呈現(xiàn)高發(fā)病率，中國(guó)約將近一半的肝臟疾病患者是NAFLD患者。伴隨著我國(guó)肥胖、代謝綜合征及糖尿病的高發(fā)病率，NAFLD的發(fā)病率逐年升高。目前臨床在治療上沒(méi)有有效而證據(jù)指數(shù)高的藥物，中醫(yī)藥在脂肪肝、高脂血癥及肥胖的治療中具

2、有一定的優(yōu)勢(shì)。尋找有效安全的NAFLD中醫(yī)藥治療方法并對(duì)其治療機(jī)制進(jìn)行探索具有重要意義。非酒精性脂肪肝從中醫(yī)角度認(rèn)為是脾虛不運(yùn)，痰濁內(nèi)阻為病，因此臨床上主要采用健脾泄?jié)岱ㄟM(jìn)行治療，臨床上我們采用《金匱》澤瀉湯加熟大黃治療。
　　目的:1.通過(guò)文獻(xiàn)研究分析近10年臨床治療NAFLD的用藥規(guī)律;2.通過(guò)評(píng)估不同脂肪含量的高脂純化飼料尋找有效、重復(fù)性高的NAFLD建模飼料;3.通過(guò)低、中、高劑量的加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠，選擇最佳的

3、治療劑量;4.通過(guò)宏基因組學(xué)的方法探討腸道微生物在加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠中的潛在機(jī)制;5.通過(guò)急性毒理實(shí)驗(yàn)對(duì)加味澤瀉湯的毒性進(jìn)行評(píng)估;6.通過(guò)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)對(duì)水煎劑加味澤瀉湯及物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析，建立質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
　　方法:1.檢索2004年至2014年中醫(yī)藥治療NAFLD的臨床文獻(xiàn)，通過(guò)用藥頻次分析臨床中治療NAFLD的病機(jī)及用藥規(guī)律;2.采用45％及60％脂肪含量高脂純化飼料建立NAFLD小鼠，通過(guò)一

4、般情況、血脂血糖、糖耐量實(shí)驗(yàn)及肝臟病理評(píng)估兩種飼料的造模程度，對(duì)建模飼料進(jìn)行選擇;3.采用低、中、高劑量的加味澤瀉湯對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)一般情況、血糖血脂、糖耐量實(shí)驗(yàn)及肝臟病理評(píng)估不同劑量對(duì)NAFLD小鼠的治療效應(yīng);4.采用加味澤瀉湯對(duì)NAFLD小鼠進(jìn)行治療，檢測(cè)肝功能、肝臟HE及Masson染色、RT-qPCR法檢測(cè)肝內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平、免疫組化及western-blotting檢測(cè)回腸結(jié)腸中緊密連接蛋白o(hù)cc

5、ludin蛋白表達(dá)、高通量測(cè)序法檢測(cè)小鼠糞便16S rRNA分析糞便微生物，挖掘加味澤瀉湯的潛在治療機(jī)制;5.給予雌雄小鼠最大給藥劑量的加味澤瀉湯7天，觀察是否死亡、體重及重要臟器病理，對(duì)加味澤瀉湯進(jìn)行急性毒理評(píng)估;6.通過(guò)UPLC-MS對(duì)水煎劑加味澤瀉湯及物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析，比對(duì)蒼術(shù)酮、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素及2，3-乙酰澤瀉醇B等對(duì)照品，并通過(guò)質(zhì)譜圖譜對(duì)其他物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析。
　　結(jié)果:1.文獻(xiàn)研究中，我們對(duì)近10年來(lái)非酒精

6、性脂肪肝的臨床文獻(xiàn)進(jìn)行用藥頻次及規(guī)律研究，共檢索出藥物147種治療藥物，藥物總是使用頻次為960次。高頻使用的藥物主要為丹參7.57％、山楂7.03％、澤瀉5.95％、柴胡5.73％、茯苓4.97％、白術(shù)4.11％、決明子4.11％等，按功能主要?dú)w于利水滲濕藥、補(bǔ)虛藥及活血化瘀藥。從用藥角度證實(shí)非酒精性脂肪肝脾運(yùn)不健，痰濁內(nèi)阻的病機(jī)，及運(yùn)用健脾泄?jié)岱ㄖ委煹暮侠硇浴?br>　　2.對(duì)不同脂肪含量攝入的高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，

7、45％與60％脂肪含量高脂純化飼料均能出現(xiàn)體重增加、肝臟及脂肪重量增加、血脂血糖異常、胰島素抵抗、肝臟呈現(xiàn)脂肪變，顯示這兩種飼料均能較好的誘導(dǎo)出NAFLD小鼠模型，兩者差異不顯著，認(rèn)為45％脂肪含量飼料已能滿足實(shí)驗(yàn)需要。
　　3.在低、中、高劑量加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠的效應(yīng)研究中，經(jīng)4周治療加味澤瀉湯可顯著減輕NAFLD小鼠血清AST、肝臟及病理評(píng)分，在體重、血清ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C方面有一定改善趨勢(shì)，

8、但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在低、中、高三個(gè)劑量組中，以低劑量與中劑量組整體治療效果更好。整體結(jié)果顯示，雖然加味澤瀉湯在改善NAFLD小鼠體重、胰島素抵抗及血脂有一定效果，但在其在改善肝內(nèi)炎癥反應(yīng)的效應(yīng)更佳，這對(duì)我們的機(jī)制探討具有指導(dǎo)意義。
　　4.對(duì)加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠治療的機(jī)制探討中，主要注重于腸道微生物-腸道屏障-肝內(nèi)炎癥反應(yīng)的研究。結(jié)果顯示，(1)加味澤瀉湯可減輕血清AST水平，改善肝臟組織炎癥性改變，減少肝臟內(nèi)膠原纖維沉積

9、，減小脂肪細(xì)胞體積。(2)加味澤瀉湯可降低由高脂模型誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)炎癥因子的高表達(dá)，可降低IL-1β、TNFα及F4/80mRNA的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;具有降低TLR4、NLRP3mRNA表達(dá)量的趨勢(shì);對(duì)IL-10、IL-18、Caspase-1表達(dá)無(wú)作用。(3)對(duì)腸粘膜屏障完整性具有重要意義的緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，加味澤瀉湯對(duì)回腸、結(jié)腸未改變基本結(jié)構(gòu);在回腸與結(jié)腸的免疫組化及western-blotting中，模型組oc

10、cludin表達(dá)量顯著下降，加味澤瀉湯治療后可回復(fù)其表達(dá)。(4)在對(duì)腸道微生物16SrRNA豐度、多樣性的研究中，Ace指數(shù)模型組較空白組下降，給藥組較空白組也下降;Chao指數(shù)，模型組較空白組下降，給藥組較空白組下降;Shannon指數(shù)模型組較空白組下降，給藥組較空白組下降;Simpson指數(shù)模型組較空白組升高，給藥組較模型組指數(shù)有所下降，提示模型組及藥物組較空白組腸道微生物豐度及多樣性下降。(5)在門(mén)的分類學(xué)水平上，高脂飲食及加味澤

11、瀉湯的運(yùn)用均能造成腸道微生物組成的較大;擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)在模型組較空白組升高，加味澤瀉湯組較空白組Bacteroidetes升高;厚壁菌門(mén)（Firmicute）在模型組及給藥組均出現(xiàn)了下降;變形菌門(mén)(Proteobacteria)在模型組出現(xiàn)升高，經(jīng)加味澤瀉湯干預(yù)后占比下降，此外脫鐵菌門(mén)(Deferribacteres)也出現(xiàn)了與Proteobacteria一樣的變化。(6)在屬的分類學(xué)水平上，脫硫弧菌屬(Desu

12、lfovibrio) OTU數(shù)量在模型組顯著增長(zhǎng)，經(jīng)加味澤瀉湯治療后下降到與空白組一致的水平;普雷沃氏菌屬(Prevotella)在模型組數(shù)量增加，加味澤瀉湯治療后可降低其數(shù)量;在羅氏菌屬(Roseburia)及Lachnospiraceae_Incertae_Sedis屬的數(shù)量表現(xiàn)也與Desulfovibrio、Prevotella一致。
　　5.通過(guò)對(duì)加味澤瀉湯的急性毒性實(shí)驗(yàn)，確定其毒理反應(yīng)，以最大濃度最大容量灌胃給藥，連續(xù)觀

13、察7d。結(jié)果顯示，無(wú)動(dòng)物死亡、無(wú)中毒反應(yīng)，肝臟及腎臟病理改變。加味澤瀉湯最大受試劑量是臨床常規(guī)劑量的111倍，認(rèn)為加味澤瀉湯無(wú)明顯急性毒理反應(yīng)。
　　6.通過(guò)對(duì)加味澤瀉湯物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，結(jié)果顯示，(1)根據(jù)色譜峰比對(duì)蒼術(shù)酮、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素及2，3-乙酰澤瀉醇B的對(duì)照品及加味澤瀉湯中的物質(zhì)，加味澤瀉湯中存在及大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素及2，3-乙酰澤瀉醇B，但未找到蒼術(shù)酮的色譜峰。(2)結(jié)合質(zhì)譜圖譜分析，加味澤瀉湯中除以

14、上物質(zhì)外，還可能存在沒(méi)食子酸、大黃酚、大黃素甲醚、澤瀉醇A醋酸酯、澤瀉醇C單乙酸酯、澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。(3)對(duì)照品中找白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的色譜峰，考慮蒼術(shù)酮經(jīng)氧化可轉(zhuǎn)化為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。
　　結(jié)論:結(jié)合文獻(xiàn)研究及實(shí)驗(yàn)研究，加味澤瀉湯藥符合NAFLD病機(jī)，其主要物質(zhì)基礎(chǔ)均具有一定的降脂及改善肝臟炎癥的作用，加味澤瀉湯對(duì)高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠具有良好的治療的效果，可能通