ADAMTS13依賴性血管性血友病因子水解相關(guān)影響因素的研究.pdf

1、血管性血友病因子(VWF)是存在于血漿中的一種重要的止血相關(guān)蛋白，主要由血管內(nèi)皮細胞和巨核細胞/血小板合成和分泌，在初期止血和二期止血中均發(fā)揮重要作用。VWF在血漿中是以多聚體的形式存在的，其分子量介于500～20，000kDa之間。同時，VWF與血小板的粘附活性直接與其多聚體的分子量大小成正相關(guān)。VWF多聚體分子量的大小則主要由血漿中的一種稱為ADAMTS13的金屬蛋白酶來調(diào)節(jié)的，它是通過剪切VWF-A2功能域內(nèi)的Tyr1605-Me

2、t1606之間的肽腱而實現(xiàn)的。VWF多聚體的這一生理性水解受到多種因素的影響或調(diào)控，如VWF空間構(gòu)象、流體剪切力、ABO血型、血漿酸堿度和部分二價陽離子等。同時，某些病理因素或狀態(tài)亦會影響到ADAMTS13對VWF的水解活性，如ADAMTS13自身抗體、ADAMTS13或VWF基因缺陷以及ADAMTS13或VWF的基因多態(tài)性等。其中有兩種相反的病理狀態(tài)均具有重要的臨床意義：ADAMTS13自身抗體或基因缺陷導(dǎo)致其酶活性的明顯降低或缺乏，

3、從而在臨床上發(fā)生特發(fā)性或遺傳性血栓性血小板減少性紫癜(TTP)；而VWF的某些基因缺陷則導(dǎo)致VWF對ADAMTS13異常敏感而被ADAMTS13過度水解，即2A型和2B型血管性血友病(VWD)。本研究分為三個部分：
　　 ㈠抗VWF單克隆抗體對ADAMTS13水解VWF活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)多種因素可以通過與VWF的結(jié)合而影響ADAMTS13介導(dǎo)的VWF水解。其中，能夠分別與VWF-A1區(qū)和D'D3區(qū)結(jié)合的血小板和因子Ⅷ均能在流體

4、剪切力條件下促進ADAMTS13對VWF多聚體的裂解。與此相反，血小板敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)則通過與ADAMTS13競爭性結(jié)合VWF-A3區(qū)而抑制ADAMTS13對VWF的水解活性。為了探討抗VWT單抗是否可以通過與VWF的結(jié)合而影響ADAMTS13對VWT的水解活性，本研究應(yīng)用了針對人VWF不同功能域的八種鼠源性單抗進行了相關(guān)研究，它們分別是1C1E7和75H4B12(抗VWF-D'D3區(qū))，SZ

5、129和SZ130(抗VWF-A1區(qū))，SZ29和SZ34(抗VWF-A2區(qū))和SZ123和SZ125(抗VWF-A3區(qū))。分別觀察了不同濃度的各種抗VWF單抗在高剪切力條件下和靜態(tài)條件下對ADAMTS13酶解VWF活性是否具有影響作用。另外，對其中一種能夠在高剪切力條件下抑制ADAMTS13對VWF水解活性的抗VWF-A2區(qū)單抗(SZ34)進行了抗原表位的鑒定。首先，將不同濃度的抗VWF單抗分別與純化的血漿源VWF(pVWF)進行孵育

6、，再加入重組ADAMTS13(rADAMTS13)，然后置于微型渦旋器(mini vortexer)上，以2500rpm渦旋5分鐘，最后進行VWF多聚體電泳、非還原SDS-PAGE和Westernblot分析，判定在高剪切力條件下抗VWF單抗對ADAMTS13水解VWF活性的影響。結(jié)果顯示SZ34在高剪切力條件下對ADAMTS13裂解VWF的活性具有明顯抑制作用，并且呈劑量依賴性抑制。而其它幾種抗VWF單抗在高剪切力條件下對ADAMTS

7、13水解VWF的活性均無影響作用。其次，將pVWF用鹽酸胍進行預(yù)變性后與不同濃度的抗VWF單抗孵育，然后再加入rADAMTS13進行酶切，以此來判定在靜態(tài)/變性條件下抗VWF單抗對ADAMTS13水解VWF活性的影響。結(jié)果顯示，包括SZ34在內(nèi)的八種抗VWF單抗在靜態(tài)/變性條件下對ADAMTS13水解VWF的活性均無影響。另外，我們還在不加入尿素或鹽酸胍等變性劑的條件下直接觀察了SZ34對ADAMTS13依賴性R1597W突變體VWF的

8、水解的影響，結(jié)果顯示SZ34在靜態(tài)/非變性條件下對VWF水解亦無影響。最后，應(yīng)用VWF的多種相關(guān)蛋白對SZ34進行了抗原表位的鑒定。除了pVWF為直接應(yīng)用人凝血因子Ⅷ濃縮物純化得到外，其他均為包含VWF不同功能域或結(jié)構(gòu)的重組蛋白，包括D'D3(S764P1247-H)、A1A2A3(Q1238G1874-H)、A1(H-E1260P1467)、A2(H-G1481R1668)、A3(S1681R1877-H)、A2-12(GST-D14

9、59G1595-H)、A2-23(VWF114，GST-A1555R1668-H)、A2-1(GST-D1459E1554-H)、A2-2(GST-A1555G1595-H)和A2-3(VWF73，GST-D1596R1668-H)等。應(yīng)用VWF的這些相關(guān)蛋白通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)聯(lián)合Western blot等技術(shù)對SZ34的抗原表位進行了鑒定。結(jié)果表明SZ34為一種構(gòu)象特異性抗VWF單抗，其抗原表位位于VWF蛋白A2功能域

10、的A1555-G1595片段內(nèi)。這些結(jié)果提示VWF-A2功能域內(nèi)的A1555-G1595區(qū)段可能部分或全部呈構(gòu)成性暴露于自然狀態(tài)的VWF表面，并在ADAMTS13依賴性VWF水解過程中發(fā)揮重要的作用。
　　 ㈡VWF蛋白A1500E突變對其ADAMTS13依賴性水解的敏感性的影響。研究發(fā)現(xiàn)VWF的突變可以導(dǎo)致ADAMTS13依賴性VWF水解敏感性的改變，這包括2A型和2B型VWD突變。其中，2A型突變在發(fā)病機制方面分為兩組突變類

11、型。第一組突變引起VWF多聚體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運和分泌障礙；第二組突變則不影響VWF多聚體的合成和分泌，但其VWF多聚體對血漿中的某種蛋白水解酶即ADAMTS13異常敏感而被過度水解。為了探討VWF蛋白A1500E突變體對金屬蛋白酶ADAMTS13依賴性水解的敏感性的改變，為VWF-A1500E突變導(dǎo)致2A型VWD的發(fā)病機制提供直接依據(jù)，在前期相關(guān)工作的基礎(chǔ)上將野生型VWF質(zhì)粒和A1500E突變體VWF質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染Hela

12、細胞，收集并濃縮培養(yǎng)上清，分別用重組人ADAMTS13進行水解，然后通過SDS-瓊脂糖凝膠電泳進行VWF多聚體分析，觀察與野生型VWF相比，A1500E突變體VWF對ADAMTS13的敏感性有無改變。結(jié)果顯示在無尿素和鹽酸胍等變性劑的靜態(tài)條件下，rADAMTS13即可對A1500E突變體VWF進行有效的水解，即VWF多聚體分析顯示大中分子量VWF多聚體明顯減少和小分子量VWF多聚體明顯增多；相反，野生型VWF在非變性條件下則缺乏被rAD

13、AMTS13水解的證據(jù)。上述結(jié)果表明A1500E突變導(dǎo)致突變體VWF對ADAMTS13的敏感性異常性增高，符合第二組2A型VWD的突變特點。
　　 ㈢ADAMTS13富半胱氨酸域R498C突變的分子機制研究。TTP至少可以分為遺傳性、特發(fā)性和繼發(fā)性三種臨床類型。研究證實，絕大多數(shù)遺傳性TTP的ADAMTS13活性嚴重降低(多<10％)，主要是由于ADAMTS13的基因突變所導(dǎo)致的。ADAMTS13基因突變沒有“熱點”區(qū)域，廣泛分

14、布在ADAMTS13的9個結(jié)構(gòu)域的外顯子和部分內(nèi)含子中，50％以上的突變?yōu)殄e義突變，其余有移碼突變、無義突變、剪接異常和堿基缺失等。對于一例在妊娠期發(fā)作的女性TTP患者進行了分子發(fā)病機制的研究。首先，應(yīng)用尿素變性條件下的VWF水解結(jié)合VWF多聚體電泳的方法測定了血漿ADAMTS13活性，結(jié)果提示患者血漿ADAMTS13酶活性缺如，且不存在抗ADAMTS13自身抗體。隨后，從患者的白細胞中抽提基因組DNA，然后對ADAMTS13基因的所有

15、29個外顯子(包括內(nèi)含子和外顯子交界區(qū)序列)進行擴增和DNA測序，結(jié)果顯示ADAMTS13基因的第13號外顯子的1492位核苷酸序列由C突變?yōu)門，從而造成ADAMTS13蛋白富半胱氨酸域498位氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)榘腚装彼?Cys)，并且在正常人群沒有發(fā)現(xiàn)此多態(tài)性。此突變?yōu)锳DAMTS13的一種新的突變類型，在國際上尚無報道。接著，又采用基因重組和體外定點突變技術(shù)，構(gòu)建了ADAMTS13-R498C突變體。最后，將野生型和突變體