犬γ干擾素的可溶表達及其產物的活性鑒定.pdf

1、干擾素是一種多功能的細胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤以及免疫調節(jié)等功能，分為Ⅰ和Ⅱ兩個型。Ⅰ型IFN包括α、β、ω等亞型，而Ⅱ型IFN則只有γ一個型。IFN-α主要由白細胞產生，與IFN-β，IFN-ω作用于同一受體，而IFN-γ主要由NK細胞、CD4+Th1細胞以及CD8+T細胞產生。
　　 近年來，犬病毒性疾病在全球范圍內呈現(xiàn)出越來越嚴重的趨勢，狂犬病、犬細小病毒病等有些病毒是人畜共患病的病原，給人們帶來了不小的危害，已經引起全

2、社會的關注。因此，從獸醫(yī)和人醫(yī)臨床角度出發(fā)，綜合控制犬病毒性疾病意義重大。干擾素能夠通過阻斷病毒的繁殖及復制，具有良好的臨床療效，因此研究有關犬干擾素的生物制品勢在必行。
　　 但是，目前利用原核系統(tǒng)表達的犬干擾素-γ(CaIFN-γ)多以包涵體形式存在，為無生物學活性的蛋白質，需要經過體外重新折疊復性后才能恢復為具有生物活性的干擾素，但是包涵體復性效率低，而且復性后蛋白的活性并不能得到保證，這成為犬干擾素-γ大量制備和應用于實

3、踐的瓶頸問題。
　　 因此，本文對犬γ干擾素的可溶表達進行探討，旨在可溶性表達目的基因CaIFN-γ，獲得具有生物活性的CaIFN-γ蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)SUMO可作為分子伴侶來增加外源蛋白的穩(wěn)定性和可溶性，其作用機理可能是SUMO蛋白作為一個高度疏水的核心，為目的蛋白的折疊提供成核位點，促進蛋白間的相互作用并使其正確折疊，最終增強了融合蛋白的可溶性。本研究采用SUMO融合表達系統(tǒng)，經IPTG誘導后電泳結果顯示:在超聲破碎后的上

4、清中有大部分的目的蛋白表達。進而在實驗過程中對誘導時間、誘導劑濃度及誘導溫度等表達條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)誘導時間對CaIFN-γ蛋白表達量影響較大，在誘導4h時蛋白表達量較高。而IPTG濃度對此融合蛋白表達影響較小，為了減少對菌體的傷害，本實驗選擇了0.25 mmol/L的IPTG濃度。溫度變化對該蛋白表達也有影響，在20℃時菌體生長較慢蛋白表達量也較低，因此本實驗選擇了常規(guī)誘導溫度37℃。在最優(yōu)的表達條件下:當菌株處于對數(shù)生長期，選擇誘

5、導劑終濃度為0.25 mmol/L、誘導溫度為37℃、誘導時間為4h，產物量及表達量達到最優(yōu)，破碎后SDS-PAGE分析蛋白表達量，上清中蛋白含量占菌體蛋白總量的50％，這與以往利用其它表達載體表達CaIFN-γ相比，大大提高了蛋白的可溶性表達，解決了包涵體變性復性影響蛋白活性的瓶頸問題，為以后CaIFN-γ的研究及大規(guī)模發(fā)酵生產奠定了基礎。
　　 傳統(tǒng)方法在檢測犬干擾素活性時，一般采用MDCK-VSV檢測系統(tǒng)，VSV病毒本身存

6、在危險性，導致豬，牛等哺乳動物和人共感染，并且培養(yǎng)病毒時還存在潛在危險性，病毒會出現(xiàn)不可預測的變異，導致毒力改變，而且檢測TCID50時費時費力，因此本研究建立了一種安全、快速、靈敏的犬γ干擾素活性檢測方法，也為今后更好的研究干擾素的抗病毒、抗腫瘤活性的作用機理奠定基礎。本文以MDCK細胞為靶細胞，采用MTT法檢測犬γ干擾素對該細胞增殖的抑制作用。結果表明，犬干擾素-γ對MDCK細胞呈明顯的抑制作用。流式細胞儀檢測CaIFN-γ蛋白有效

7、誘導MDCK細胞發(fā)生凋亡和壞死，結果表明CaIFN-γ蛋白能夠顯著誘導MDCK細胞發(fā)生凋亡。 Real-time PCR法檢測犬γ干擾素刺激MDCK細胞后，細胞內源p53 mRNA水平的變化，結果顯示，p53的表達量與犬γ，干擾素的劑量和時間呈依賴性關系。通過以上方法說明我們所表達的可溶性CaIFN-γ蛋白是具有生物活性的。
　　 本研究建立了犬γ干擾素的可溶表達方法并建立一種快速、方便的犬γ干擾素活性檢測方法，為進一步研究及生