犬γ干擾素的可溶表達(dá)及其產(chǎn)物的活性鑒定.pdf

1、干擾素是一種多功能的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等功能，分為Ⅰ和Ⅱ兩個(gè)型。Ⅰ型IFN包括α、β、ω等亞型，而Ⅱ型IFN則只有γ一個(gè)型。IFN-α主要由白細(xì)胞產(chǎn)生，與IFN-β，IFN-ω作用于同一受體，而IFN-γ主要由NK細(xì)胞、CD4+Th1細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生。
　　 近年來，犬病毒性疾病在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出越來越嚴(yán)重的趨勢(shì)，狂犬病、犬細(xì)小病毒病等有些病毒是人畜共患病的病原，給人們帶來了不小的危害，已經(jīng)引起全

2、社會(huì)的關(guān)注。因此，從獸醫(yī)和人醫(yī)臨床角度出發(fā)，綜合控制犬病毒性疾病意義重大。干擾素能夠通過阻斷病毒的繁殖及復(fù)制，具有良好的臨床療效，因此研究有關(guān)犬干擾素的生物制品勢(shì)在必行。
　　 但是，目前利用原核系統(tǒng)表達(dá)的犬干擾素-γ(CaIFN-γ)多以包涵體形式存在，為無生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，需要經(jīng)過體外重新折疊復(fù)性后才能恢復(fù)為具有生物活性的干擾素，但是包涵體復(fù)性效率低，而且復(fù)性后蛋白的活性并不能得到保證，這成為犬干擾素-γ大量制備和應(yīng)用于實(shí)

3、踐的瓶頸問題。
　　 因此，本文對(duì)犬γ干擾素的可溶表達(dá)進(jìn)行探討，旨在可溶性表達(dá)目的基因CaIFN-γ，獲得具有生物活性的CaIFN-γ蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)SUMO可作為分子伴侶來增加外源蛋白的穩(wěn)定性和可溶性，其作用機(jī)理可能是SUMO蛋白作為一個(gè)高度疏水的核心，為目的蛋白的折疊提供成核位點(diǎn)，促進(jìn)蛋白間的相互作用并使其正確折疊，最終增強(qiáng)了融合蛋白的可溶性。本研究采用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后電泳結(jié)果顯示:在超聲破碎后的上

4、清中有大部分的目的蛋白表達(dá)。進(jìn)而在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)溫度等表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CaIFN-γ蛋白表達(dá)量影響較大，在誘導(dǎo)4h時(shí)蛋白表達(dá)量較高。而IPTG濃度對(duì)此融合蛋白表達(dá)影響較小，為了減少對(duì)菌體的傷害，本實(shí)驗(yàn)選擇了0.25 mmol/L的IPTG濃度。溫度變化對(duì)該蛋白表達(dá)也有影響，在20℃時(shí)菌體生長(zhǎng)較慢蛋白表達(dá)量也較低，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了常規(guī)誘導(dǎo)溫度37℃。在最優(yōu)的表達(dá)條件下:當(dāng)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，選擇誘

5、導(dǎo)劑終濃度為0.25 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間為4h，產(chǎn)物量及表達(dá)量達(dá)到最優(yōu)，破碎后SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)量，上清中蛋白含量占菌體蛋白總量的50％，這與以往利用其它表達(dá)載體表達(dá)CaIFN-γ相比，大大提高了蛋白的可溶性表達(dá)，解決了包涵體變性復(fù)性影響蛋白活性的瓶頸問題，為以后CaIFN-γ的研究及大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 傳統(tǒng)方法在檢測(cè)犬干擾素活性時(shí)，一般采用MDCK-VSV檢測(cè)系統(tǒng)，VSV病毒本身存

6、在危險(xiǎn)性，導(dǎo)致豬，牛等哺乳動(dòng)物和人共感染，并且培養(yǎng)病毒時(shí)還存在潛在危險(xiǎn)性，病毒會(huì)出現(xiàn)不可預(yù)測(cè)的變異，導(dǎo)致毒力改變，而且檢測(cè)TCID50時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此本研究建立了一種安全、快速、靈敏的犬γ干擾素活性檢測(cè)方法，也為今后更好的研究干擾素的抗病毒、抗腫瘤活性的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本文以MDCK細(xì)胞為靶細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)犬γ干擾素對(duì)該細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果表明，犬干擾素-γ對(duì)MDCK細(xì)胞呈明顯的抑制作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CaIFN-γ蛋白有效

7、誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，結(jié)果表明CaIFN-γ蛋白能夠顯著誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞發(fā)生凋亡。 Real-time PCR法檢測(cè)犬γ干擾素刺激MDCK細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)源p53 mRNA水平的變化，結(jié)果顯示，p53的表達(dá)量與犬γ，干擾素的劑量和時(shí)間呈依賴性關(guān)系。通過以上方法說明我們所表達(dá)的可溶性CaIFN-γ蛋白是具有生物活性的。
　　 本研究建立了犬γ干擾素的可溶表達(dá)方法并建立一種快速、方便的犬γ干擾素活性檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究及生