人干擾素—β在生菜中的表達(dá)、鑒定和生物活性研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人或動物基因工程藥物蛋白已成為植物基因工程的一個新興研究領(lǐng)域。與目前的細(xì)菌、酵母及哺乳動物細(xì)胞等傳統(tǒng)藥物蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)相比，用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程藥物蛋白具有其獨特的優(yōu)勢：成本低，可以以農(nóng)業(yè)化的規(guī)模生產(chǎn)昂貴的生化藥物；完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，使表達(dá)產(chǎn)物具有較好的生物活性；安全性好，無外源性病原污染；口服植物疫苗能誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，生產(chǎn)簡便、成本低廉，不需要冷藏和低溫運輸。但植物表達(dá)存

2、在表達(dá)量低、下游分離純化困難等嚴(yán)重問題，因此尋找新的轉(zhuǎn)基因植物受體，開發(fā)新的植物表達(dá)系統(tǒng)，成為植物生物反應(yīng)器研究的重點。 本研究以葉用生菜(Lactuca sativa L．sp)為試驗材料，探討優(yōu)化生菜農(nóng)桿菌真空滲透瞬時轉(zhuǎn)化方法和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)體系，采用瞬時轉(zhuǎn)化方法將四種不同的干擾素一B基因轉(zhuǎn)入生菜中，研究生菜瞬時表達(dá)干擾素-β的水平和生物活性，獲得結(jié)果如下： 1．對生菜的瞬時表達(dá)方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，建立了適宜生菜高

3、效瞬時表達(dá)的轉(zhuǎn)化體系(200 μ mol/L乙酰丁香酮、0.80D<,600>菌液密度、真空處理30min、共培養(yǎng)6d)。以條件A<,1>B<,1>C<,1>D<,1>(0 μmol/L乙酰丁香酮、0.40D<,600>菌液密度、真空處理10min、共培養(yǎng)2d)為對照，應(yīng)用結(jié)果表明：優(yōu)勢組合的GUS表達(dá)水平為21.39nmol·mg<'-1>·min<'-1>MU，比對照(1.3l nmol·mgl·min<'-1>MU)提高16.3倍

4、。結(jié)果表明該生菜瞬時表達(dá)體系可有效的提高外源基因的表達(dá)。 2．糖蛋白藥物干擾素-β在生菜葉片中成功表達(dá)為27kDa．的蛋白，推測為帶有植物特有糖基化形式的糖蛋白；抗病毒活性表明，該干擾素-β能抑制水泡性口膜炎病毒對人羊膜wish細(xì)胞的攻擊，這也是首次對農(nóng)桿菌真空滲透瞬時表達(dá)來源的生化藥物進(jìn)行生物活性檢測的報道。由于基因定點突變使第17位半胱氨酸改為絲氨酸(Cys-Set)，去除了Cysl7對正常二硫鍵(Cys31和Cys141)

5、的影響，使干擾素β的空間結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，因此，突變型的干擾素表達(dá)量和活性高于原始型干擾素。四種干擾素一B(IFN,無信號肽的干擾素-β；sIFN有信號肽的干擾素-β：mIFN,無信號肽突變型的干擾素-β：smIFN,有信號肽突變型的干擾素-β)表達(dá)產(chǎn)物的活性分別為： 3.1×10<'4>IU/mL，5.8×10<'4>IU/mL，6.3×10<'4>IU/mL，9.8×10<'4>IU/mL；表達(dá)量也依次升高。表明：Cys17向Ser17的

6、改變及信號肽的添加有利于干擾素-β表達(dá)量和活性的提高，可以利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法快速、大量、廉價的生產(chǎn)人源細(xì)胞因子、疫苗等生化藥物。 3．為探討干擾素-β在植物中的糖基化形式，構(gòu)建含有糖基酶PNGase F的植物雙元表達(dá)載體pBl121-F將含有pBl121-F的農(nóng)桿菌GV3101與含有pBl121-smIFN的農(nóng)桿菌GV3101混合后，真空滲透轉(zhuǎn)化生菜葉片，以期利用PNGalSe F的酰胺內(nèi)切酶作用將干擾素-β的糖鏈切除

7、，但通過Western檢測，沒有發(fā)現(xiàn)干擾素-β分子量的變化，可能是由于干擾素-β的表達(dá)量較低，不能檢測到：PNGase F的作用，也可能是由于植物糖基化結(jié)構(gòu)中含有較多的α-1，3一巖藻糖，α-1，3-巖藻糖的位阻影響了PNGase F的酶切作用。 4．以三種不同基因型生菜(日本生菜，美國大葉速生，泰國生菜)的兩種外植體(10d齡的子葉和真葉)為材料，建立了適合多種基因型生菜組織培養(yǎng)和植株再生體系：MS培養(yǎng)基添加0.1 mg/L

8、NAA和0.1-0.5mg/L 6-BA，為不同基因型生菜的最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基；基因型不同，所要求的激素濃度配比也不同：日本生菜的高效不定芽誘導(dǎo)激素配比為0.1mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA，美國大葉速生為0.3mg/L 6-BA and 0.1mg/L NAA，泰國生菜為0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；真葉的不定芽分化率顯著高于子葉的分化率。最適的生根培養(yǎng)基為添加0.1mg/L NAA的MS；生菜不定芽