重組人白細(xì)胞介素24的表達(dá)及其生物學(xué)活性鑒定.pdf

1、1995年P(guān).B.Fisher用差減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個新的與人黑色素瘤分化相關(guān)基因，當(dāng)時稱為mda-7（melanoma differentiation-associated gene 7），并發(fā)現(xiàn)隨著黑色素瘤細(xì)胞生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，mda-7的表達(dá)逐漸減少至最終消失，證實(shí)了其表達(dá)產(chǎn)物MDA-7具有抑制黑色素瘤細(xì)胞增生、促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞終末分化的能力。隨后，MDA-7一直作為腫瘤抑制物被研究。直到2002年，Caudell等研究證實(shí)了MDA

2、-7的細(xì)胞因子屬性，重新命名為人白細(xì)胞介素24（Human interleukin-24，hIL-24）。迄今為止，已有大量實(shí)驗(yàn)證明hIL-24具有顯著的選擇性抑制多種腫瘤生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，這種抑制作用不依賴p53、Rb和p16等抑癌基因的狀態(tài)，且對正常細(xì)胞沒有影響。hIL-24作為細(xì)胞因子，不僅在激活免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)整個抗癌免疫反應(yīng)和造血系統(tǒng)中起重要作用，還具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移作用，其顯著

3、的抗腫瘤特性使之成為腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)。2004年，Introgen公司研制的基因治療制劑Ad.IL-24，即重組復(fù)制缺陷型腺病毒-IL-24，商品名為INGN 241，獲美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，體內(nèi)外試驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了hIL-24顯著的抗腫瘤效果。隨著對hIL-24作用機(jī)制和基因治療方面深入的研究，一方面肯定了hIL-24生物學(xué)功能和治療效果，另一方面表現(xiàn)出對hIL-24的大量需求，所以，通過基因工程手段大規(guī)模生產(chǎn)高純度

4、有活性的重組hIL-24成為必然。本研究分別采用大腸桿菌（原核）表達(dá)系統(tǒng)制備了融合蛋白Trx-IL-24，并用腸激酶酶切Trx-IL-24得到重組蛋白IL-24，以及采用畢赤酵母（真核）表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)了重組糖蛋白rIL-24，分析鑒定了三種重組蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性，為深入研究其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制和腫瘤治療應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 研究目的：構(gòu)建hIL-24的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，獲得三種重組蛋白Trx-IL-

5、24、IL-24和rIL-24。建立Trx-IL-24和IL-24的制備、純化及復(fù)性的中試生產(chǎn)工藝。篩選高效分泌表達(dá)rIL-24的重組畢赤酵母工程菌。鑒定三種重組蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。 研究方法： 1）人白細(xì)胞介素24基因的克隆 采用RT-PCR和nested-PCR方法，從ConA 刺激培養(yǎng)的人外周血單個核細(xì)胞中，克隆帶信號肽的hIL-24編碼序列（hmIL-24）和不帶信號肽的hIL-24編碼序列（h

6、IL-24）。 2）人白細(xì)胞介素24基因在大腸桿菌中的表達(dá)與純化 為避免引入多余的氨基酸，利用載體pET32a(+)上的腸激酶識別位點(diǎn)編碼堿基之前的KpnⅠ位點(diǎn)，及多克隆位點(diǎn)BamHⅠ，將hIL-24插入到pET32a(+)中，構(gòu)建重組基因工程菌pET32a-hIL-24/E.coli BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白Trx-IL-24。Trx-IL-24包涵體經(jīng)洗滌、溶解后，采用鎳離子親合柱層析和凝膠分子篩柱層析相結(jié)合

7、的二步法純化制備高純度的融合蛋白。用腸激酶酶切融合蛋白Trx-IL-24得到Trx和IL-24兩個多肽段，利用兩個多肽段純化標(biāo)簽和等電點(diǎn)的差異，設(shè)計兩套純化方案制備高純度IL-24重組蛋白。將純化的IL-24蛋白經(jīng)注射途徑免疫家兔，獲得兔抗IL-24抗血清，采用免疫雙擴(kuò)、ELISA及Western Blot檢測IL-24多抗的免疫反應(yīng)性。 3）人白細(xì)胞介素24基因在畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定 為避免在目的蛋白的N端引入2-6個多

8、余的氨基酸，利用載體pPIC9K上的羧肽酶B(KEX2) 識別位點(diǎn)編碼堿基之前的XhoⅠ和多克隆位點(diǎn)中的EcoRⅠ，將hIL-24插入到pPIC9K中，構(gòu)建以α因子為分泌信號的重組質(zhì)粒IL-24/pPIC9K。以及將hmIL-24插入到pPIC9K上α因子編碼堿基之前的BamHⅠ和多克隆位點(diǎn)中的EcoRⅠ之間，構(gòu)建以自身信號肽為分泌信號的重組質(zhì)粒mIL-24/pPIC9K。采用體內(nèi)篩選法獲得多拷貝重組工程菌IL-24/pPIC9K/pi

9、chia和mIL-24/pPIC9K/pichia。利用載體pAO815體外構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒n（AOX-αIL-24）/pAO815，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得多拷貝重組工程菌n（AOX-αIL-24）pAO815/pichia。甲醇誘導(dǎo)三種重組畢赤酵母工程菌表達(dá)rIL-24。用SDS-PAGE、ELISA和Western Blot鑒定酵母表達(dá)產(chǎn)物，用糖苷酶PNGase F分析產(chǎn)物的糖基化特點(diǎn)。 4）重組hIL-24生物學(xué)活

10、性鑒定 采用MTT比色法，形態(tài)學(xué)觀察、DAN ladder實(shí)驗(yàn)，凋亡相關(guān)蛋白Bax含量變化分析以及Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)，分析大腸桿菌表達(dá)純化的Trx-IL-24和IL-24，以及酵母分泌表達(dá)的rIL-24體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。 研究結(jié)果： 1）克隆出帶信號肽的hIL-24編碼序列（hmIL-24）和不帶信號肽的hIL-24編碼序列（hIL-24）。并發(fā)現(xiàn)4份標(biāo)本中，僅有1份hIL-24的序列

11、測定結(jié)果與GenBank公布的一致。其余3份均在同一位置(第370 bp處)發(fā)生堿基的點(diǎn)突變，即T→C，該堿基的突變會帶來氨基酸的改變（Tyr→His）。 2）重組大腸桿菌pET32a-hIL-24/E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白Trx-IL-24，分子量約為35KD，主要以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白的30％。包涵體經(jīng)洗滌，在pH9.0的 8M尿素中溶解。在變性條件下，采用二步法純化，得

12、到純度為91.97％的Trx-IL-24。用腸激酶酶切融合蛋白Trx-IL-24得到Trx和IL-24兩個多肽段，利用兩個多肽段等電點(diǎn)的差異，最終確定了包涵體洗滌→溶解→復(fù)性→酶切→陽離子交換層析純化的方案，并制備出純度為95.71％的IL-24。N端氨基酸測序證實(shí)重組IL-24酶切完全，N端無多余氨基酸。IL-24免疫動物所獲得的抗血清，經(jīng)免疫雙擴(kuò)檢驗(yàn)效價為1：32，ELISA檢測滴度為600,000EU，Western Blot證實(shí)

13、兔抗IL-24多抗能夠與不同來源的重組蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。 3）體內(nèi)篩選出5株、具有4-6個表達(dá)盒拷貝的重組工程菌IL-24/pPIC9K/pichia，其中3株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)rIL-24，最高表達(dá)量約81.31±14.46mg/L。體內(nèi)篩選出5株、具有4-6個拷貝的重組工程菌mIL-24/pPIC9K/pichia，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)均無rIL-24分泌表達(dá)。體外構(gòu)建6株的具有16個表達(dá)盒拷貝的重組工程菌16（AOX-αIL-24

14、）/pAO815/pichia，其中3株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)rIL-24，最高表達(dá)量約95.93±18.72mg/L。重組畢赤酵母工程菌分泌表達(dá)的rIL-24蛋白發(fā)生了N-糖基化修飾，分別在18.4KD和24KD位置出現(xiàn)SDS-PAGE條帶和Western Blot條帶，糖肽酶PNGase F處理后24KD條帶消失。 4）通過體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Trx-IL-24、IL-24和rIL-24均具有體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

15、的活性，且對正常細(xì)胞沒有影響，酵母細(xì)胞表達(dá)的rIL-24誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于大腸桿菌表達(dá)的Trx-IL-24 和IL-24，提示了適當(dāng)?shù)暮笮揎椨欣谥亟M蛋白的生物學(xué)活性。 結(jié)論：本研究克隆出編碼人白細(xì)胞介素24的基因。hIL-24基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中融合表達(dá)，建立融合蛋白Trx-IL-24的分離、純化和復(fù)性中試工藝。制備出無多余氨基酸的IL-24，建立IL-24的分離和純化工藝，并獲得具有較好免疫反應(yīng)性的兔抗人IL-2