體細胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的研究.pdf

1、全世界有190多個國家飼養(yǎng)奶山羊，我國是奶山羊存欄量最多的國家。但我國奶山羊個體的年均奶產(chǎn)量普遍偏低。如何改良奶山羊品種，提高奶山羊的個體產(chǎn)奶量已成為畜牧工作者亟需解決的問題。生長激素（growth hormone，GH）在乳腺發(fā)育和泌乳過程中發(fā)揮著重要作用。GH不僅可以促進乳腺發(fā)育，而且能維持泌乳期乳腺上皮細胞的數(shù)量，進而增加奶產(chǎn)量。因此，本研究選用GH作為目的基因，通過體細胞核移植技術(shù)培育高產(chǎn)奶量的轉(zhuǎn)基因奶山羊新品種。
　　首

2、先，通過分子克隆技術(shù)，利用β-LG基因啟動子元件構(gòu)建能夠在乳腺中特異性表達GH的載體pcGH，然后將載體轉(zhuǎn)染到分離培養(yǎng)純化的乳腺上皮細胞中，驗證該載體能在體外分離的乳腺上皮細胞中表達GH;其次，采用電轉(zhuǎn)染的方法將線性化的載體pcGH轉(zhuǎn)染到分離培養(yǎng)的山羊胎兒成纖維細胞中，通過G418藥物篩選轉(zhuǎn)GH基因陽性細胞。進一步將轉(zhuǎn)GH基因陽性細胞移植到去核的卵母細胞中，經(jīng)融合激活待其發(fā)育到囊胚或桑椹胚后，移植到代孕母羊子宮中生產(chǎn)F0代克隆奶山羊;再

3、次，通過普通PCR、Southern-blot、熒光定量PCR和TAIL-PCR等技術(shù)方法檢測了外源基因在F0代克隆羊基因組中的整合情況;最后，為了評估轉(zhuǎn)入的GH基因?qū)δ躺窖虻挠绊懀瑢0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的生長發(fā)育、生理情況、乳腺發(fā)育及產(chǎn)奶量等生產(chǎn)性能進行跟蹤檢測，同時為了評估轉(zhuǎn)GH基因奶山羊羊奶的安全性，將F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊羊奶飼喂羔羊，跟蹤檢測小羊的生長發(fā)育及生理情況，以期獲得高產(chǎn)奶量的轉(zhuǎn)基因奶山羊。主要試驗內(nèi)容分為以下四個部

4、分:
　　1、山羊乳腺特異性表達載體pcGH的構(gòu)建及其驗證
　　本部分試驗的研究目的是構(gòu)建能夠在山羊乳腺中特異性表達的載體pcGH，并在體外分離培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞中驗證其生物學功能。首先，以薩能奶山羊為材料，從山羊的血液中提取基因組，采用PCR的方法克隆得到包含山羊β-乳球蛋白啟動子區(qū)、外顯子1在內(nèi)的5'端調(diào)控序列(β-LG5)和包含外顯子6、7及終止子在內(nèi)的3'端調(diào)控序列(β-LG3)，同時利用RT-PCR的方法，從山

5、羊的腦垂體中，克隆得到山羊gh基因;其次，以真核表達載體pV為骨架載體，先將克隆得到的β-LG5基因插入到XhoⅠ位點處，然后再將gh基因插入到β-LG5基因的下游末端EcoRⅠ位點處，再將克隆的β-LG3基因克隆到gh基因的下游末端SalⅠ位點處，構(gòu)建乳腺特異性表達載體并命名為pcGH。經(jīng)PCR和酶切驗證載體構(gòu)建正確，且測序結(jié)果無堿基突變，說明乳腺特異性表達載體pcGH構(gòu)建正確。為了驗證所構(gòu)建的載體能夠在乳腺上皮細胞中表達，我們通過組

6、織塊培養(yǎng)法從泌乳期的乳腺中分離山羊乳腺上皮細胞，并通過差異消化法對乳腺上皮細胞進行純化，純化的細胞經(jīng)免疫組化的方法驗證其為上皮細胞;最后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將乳腺特異性表達載體pcGH轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞中。于48h、60h、72h分別收集細胞上清液進行ELISA檢測，檢測結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染pcGH到山羊乳腺上皮細胞48h后，GH表達量極顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)，而60 h、72 h GH表達量有所下降，但仍顯著高于未轉(zhuǎn)

7、染組(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，乳腺特異性表達載體peGH能在培養(yǎng)的乳腺上皮細胞中表達GH蛋白。這些結(jié)果為下一步制備在乳腺中特異性表達GH的轉(zhuǎn)基因奶山羊提供了保障。
　　2、轉(zhuǎn)GH基因陽性克隆細胞的篩選及轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的制備
　　本部分研究的目的是分離培養(yǎng)山羊胎兒成纖維細胞，轉(zhuǎn)染并篩選轉(zhuǎn)GH基因陽性克隆細胞，同時用激素超排的方法獲得卵母細胞，通過體細胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)GH基因奶山羊。首先，通過組織塊培養(yǎng)法，分離培養(yǎng)了山

8、羊胎兒成纖維細胞，PCR方法鑒定分離的山羊胎兒成纖維細胞為雌性。然后使用電轉(zhuǎn)染的方法，將線性化的山羊GH乳腺特異性表達載體pcGH轉(zhuǎn)染到山羊胎兒成纖維細胞中。在轉(zhuǎn)染48 h后，更換培養(yǎng)基添加G418（500μg/mL）進行抗性篩選，在12d左右出現(xiàn)明顯的克隆團。挑取單克隆細胞團傳至48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，同時將G418濃度減半，待細胞長至80％-90％時，收集細胞，經(jīng)PCR驗證共獲得GH陽性細胞65個。饑餓處理后，凍存作為核移植的供體細胞;

9、其次，采用超排處理，從37只供體母羊中共獲取卵母細胞388枚，作為核移植的受體細胞;核移植后供融合卵數(shù)337枚，融合卵數(shù)264枚，融合率為78.34％,激活后獲得重構(gòu)胚254枚。其中115枚重構(gòu)胚直接移植到受體羊輸卵管中，共移植受體羊17只;另138枚重構(gòu)胚用瓊脂包埋，先移植到寄母羊輸卵管中，體內(nèi)培養(yǎng)5d后，回收胚126枚，其中發(fā)育到囊胚期64枚，將胚移植受體母羊子宮中，共移植39只，每只移植1-2枚。合計移植56只受體羊，至35 d檢

10、測有26只懷孕。最后，獲得6只存活的克隆羊。這些結(jié)果為下一步轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的鑒定奠定了基礎(chǔ)。
　　3、轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的鑒定
　　本研究的目的是對前期研究獲得的F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊外源基因整合的情況進行鑒定和分析。首先，通過普通PCR和Southern-blot的方法檢測，構(gòu)建的乳腺特異性表達pcGH在F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊基因組中的整合情況;其次，再通過絕對熒光定量PCR和熱不對稱交互式PCR(TAIL-PCR)的方法

11、來測定轉(zhuǎn)GH基因拷貝數(shù)和整合位點;最后，采用旁側(cè)PCR對獲得的整合位點進行驗證。PCR和Southern-blot結(jié)果表明，所獲得的克隆羊均整合有轉(zhuǎn)GH基因構(gòu)件;熒光定量PCR結(jié)果表明:GHcd-2、GHcd-7轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的拷貝數(shù)分別為12.95±0.18、12.24±1.12。TAIL-PCR檢測結(jié)果表明:經(jīng)BLAST比較分析，GHcd-2、GHcd-7兩只轉(zhuǎn)GH基因奶山羊外源基因分別整合到基因組3號和11號染色體上。這些結(jié)果為

12、轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的安全性評價奠定了基礎(chǔ)。
　　4、轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的初步安全性評價
　　本研究的目的是在前期對F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的拷貝數(shù)及整合位點鑒定的基礎(chǔ)上，進一步對轉(zhuǎn)入GH基因的奶山羊自身安全性及轉(zhuǎn)GH基因奶山羊羊奶的安全性進行初步評價。首先，通過對F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的生長發(fā)育性能進行跟蹤觀察和測定，研究外源基因?qū)δ躺窖蜃陨砩L發(fā)育性能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的生長發(fā)育情況與非轉(zhuǎn)基因奶山羊無顯著差

13、異(P＞0.05);通過對F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊血常規(guī)指標、血液生理生化指標進行定期檢測，研究外源基因?qū)ι窖蛏淼挠绊?。結(jié)果表明，F(xiàn)0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的各項生理生化指標均在正常范圍之內(nèi)并且與非轉(zhuǎn)基因奶山羊無差別（P＞0.05）。而在F0代奶山羊配種后至妊娠后期，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊乳圍、乳寬及乳頭間距等極顯著大于非轉(zhuǎn)基因奶山羊(P＜0.01)。泌乳初期，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的產(chǎn)奶量顯著高于非轉(zhuǎn)基因奶山羊(P＜0.05);而乳成分分析表明，轉(zhuǎn)G

14、H基因奶山羊羊奶的乳成分和非轉(zhuǎn)基因奶山羊羊奶無顯著差異(P＞0.05)。表明轉(zhuǎn)GH基因奶山羊在增加奶產(chǎn)量的同時，并沒有改變羊奶中各乳成分所占的比例。Western-blot檢測表明GH在奶中高表達，說明構(gòu)建的載體能夠在乳腺中表達GH蛋白;將F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的羊奶飼喂羔羊，檢測小羊的生長發(fā)育及生理生化指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小羊的生長發(fā)育及生理并未受到不良影響（P＞0.05）。本研究初步獲得了泌乳初期產(chǎn)奶量顯著增加的轉(zhuǎn)GH基因奶山羊，并對F0