體細(xì)胞核移植山羊遺傳鑒定及核移植山羊和牛全基因組DNA甲基化研究.pdf

1、體細(xì)胞核移植動(dòng)物的生產(chǎn)，在基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究方面，如農(nóng)業(yè)、遺傳資源的保護(hù)和人類醫(yī)學(xué)等，均具有廣闊的應(yīng)用前景。微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA)隨機(jī)、廣泛地分布于真核生物基因組中，具有多態(tài)性豐富、共顯性和可使用PCR方法進(jìn)行方便地檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是親子鑒定和個(gè)體身份鑒定的首選分子標(biāo)記。鑒于此，微衛(wèi)星技術(shù)也經(jīng)常用來對(duì)體細(xì)胞核移植個(gè)體進(jìn)行遺傳鑒定。DNA甲基化是體細(xì)胞核移植克隆中體細(xì)胞核“表觀遺傳重編程”的一個(gè)重要方面。大量研

2、究表明DNA甲基化重編程在附植前的克隆胚胎中發(fā)生了異常，且研究發(fā)現(xiàn)附植后克隆胎兒的甲基化與人工授精胎兒相比也呈現(xiàn)出顯著變異，這些可能與克隆效率低下和克隆動(dòng)物多發(fā)的各種機(jī)體缺陷有關(guān)。因此，從基因組水平對(duì)克隆動(dòng)物DNA甲基化進(jìn)行研究，有助于了解體細(xì)胞核移植動(dòng)物發(fā)育異常和表觀遺傳修飾的關(guān)系，也可為體細(xì)胞克隆技術(shù)的改進(jìn)提供參考。 本研究包括兩部分內(nèi)容： 第一部分：以2個(gè)已知無親緣關(guān)系的魯北白山羊個(gè)體，對(duì)36個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增和

3、聚丙烯酰胺凝膠分析，篩選出了10個(gè)多態(tài)性高的位點(diǎn)用于3只體細(xì)胞核移植山羊與其供核細(xì)胞遺傳同一性的鑒定及與其受體母羊間母子關(guān)系的排除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別在9(C1)、10(C2)和9個(gè)(F)位點(diǎn)上克隆山羊的基因型與受體母羊的不同而與供體核細(xì)胞的相同，證實(shí)了克隆山羊是由體細(xì)胞克隆而來。 第二部分：首次采用MSAP的方法，以自然繁殖個(gè)體為對(duì)照，在基因組水平上分別對(duì)3只體細(xì)胞核移植山羊和3頭體細(xì)胞核移植牛進(jìn)行DNA甲基化分析，并在體細(xì)胞核移植

4、山羊和核移植牛個(gè)體中分別找到28處和10處差異的甲基化位點(diǎn)并測(cè)序。 所測(cè)得的28個(gè)克隆山羊的差異序列與牛數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列具有很高的同源性，其中有15個(gè)序列與牛數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的同源性達(dá)92％以上，覆蓋差異序列的長(zhǎng)度幾乎達(dá)100％；大部分差異序列主要與牛數(shù)據(jù)庫(kù)中一些GNOMON預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)含子具有很高的同源性。所測(cè)得的10個(gè)克隆牛的差異序列有7個(gè)與牛數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的同源性在97％～100％之間，覆蓋差異序列的長(zhǎng)度也幾乎達(dá)100％，有

5、4個(gè)差異序列屬間隔DNA或無特征的基因組序列，另外一些差異序列為GNOMON預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)基因內(nèi)含子的一部分。將所得序列與所有物種的基因組進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，差異序列主要與一些散布序列具有很高的同源性，同源序列長(zhǎng)度在20bp以上，同源性80％～100％不等。 基于?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)克隆牛10個(gè)差異甲基化位點(diǎn)分別進(jìn)行HpaⅡ敏感PCR分析驗(yàn)證(7個(gè)位點(diǎn))和BSP分析驗(yàn)證(3個(gè)位點(diǎn))，最終證明克隆個(gè)體在其中5個(gè)位點(diǎn)(C1、C2、C9、C11