利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達α-乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因山羊.pdf

1、通過體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊，進而創(chuàng)制山羊乳腺生物反應(yīng)器、培育山羊轉(zhuǎn)基因育種新材料，在醫(yī)療、畜牧業(yè)上均具有廣闊的應(yīng)用前景。本文圍繞著建立有效、經(jīng)濟的山羊轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)平臺，針對山羊卵母細(xì)胞體外成熟與alpha乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因克隆山羊研制的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，開展了如下試驗：
　　 試驗一：總結(jié)統(tǒng)計了本地區(qū)不同月份從屠宰場所取得的卵巢，每個卵巢可獲得的有效卵母細(xì)胞數(shù)，以及本地區(qū)不同月份對卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明：10月份、1

2、1月份、12月份和1月份每個卵巢采集到的可用卵母細(xì)胞平均數(shù)量較高，分別為：1.957、1.938、1.804和2.525枚，其中 3、4、5、6、10、11、12月份之間差異不顯著，1月份與3、4、5、6月份差異顯著，1月份與10、11、12月份差異不顯著；10月份、11月份、12月份和 1月份卵母細(xì)胞成熟率也較高，分別為：55.37％、53.74％、56.61％、55.71％，其中3、4、5、6、10、11、12月差異不顯著，1月份與

3、3、4、5、6月份差異顯著，1月份與10、11、12月份差異不顯著?？傮w來說，秋冬季節(jié)左右采集的卵巢相對于其它月份，數(shù)量和質(zhì)量都較好。說明本地區(qū)1月份、10月份、11月份和12月份卵巢的采集和卵母細(xì)胞的成熟都比較好，適合試驗取材。
　　 試驗二：探索卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加維生素C（Vc）對卵母細(xì)胞成熟的影響。
　　 結(jié)果表明：添加 500μM、1000μM的 Vc組成熟率均顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，添加 1

4、000μM的 Vc組成熟率最高為：68.18％。因此，在成熟培養(yǎng)基中添加濃度為1000μM的Vc 對卵母細(xì)胞成熟有明顯的促進作用。
　　 試驗三：探討卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（hbFGF）
　　 對卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明：試驗組成熟率、卵母細(xì)胞孤雌后胚胎卵裂率都比對照組高，不過差異均不顯著（P＞0.05）。添加 50ng/mL的 hbFGF組成熟率為70.43％，卵裂率為68.49％，效

5、果最好。因此，適宜濃度的hbFGF 可促進山羊卵母細(xì)胞的體外成熟及后期發(fā)育。
　　 試驗四：比較了不同融合參數(shù)對重構(gòu)胚融合率的影響。結(jié)果表明：參數(shù)為 1.40kv/cm、3 0μs、2 DC，更能有效地融合重構(gòu)胚，融合率為68.99％。其中，與 1.40 kv/cm、30μs、1DC，120 kv/cm、30μs、2DC組差異不顯著；與120 kv/cm、30μs、1DC組顯著差異。
　　 試驗五：通過克隆小鼠α–乳清蛋

6、白（α–lactalbumin）cDNA為目的基因，以改造好的載體PBC1Neo為骨架，構(gòu)建了PBCINLact乳腺特異性表達載體。酶切和測序結(jié)果表明：成功克隆了α–乳清蛋白基因，并在載體骨架上得到正確表達。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，成功獲得攜帶該乳腺表達載體的陽性山羊胎兒成纖維體細(xì)胞。
　　 試驗六：通過以上五個試驗的準(zhǔn)備和摸索，為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊建立了相對穩(wěn)定的平臺。以帶有α–乳清蛋白基因的黃淮白山羊胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，利用體細(xì)

7、胞核移植方法，生產(chǎn)了約 220 枚胚胎。分別移植到 10 頭受體山羊子宮中，懷孕足月后，有 2 頭小羊順產(chǎn)。經(jīng)鑒定，一頭為轉(zhuǎn)α–乳清蛋白基因山羊，另一頭為克隆山羊。結(jié)果表明：成功利用體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因山羊。
　　 綜上所述，本試驗室成功獲得了國內(nèi)首例攜帶調(diào)節(jié)山羊乳汁品質(zhì)基因的轉(zhuǎn)基因克隆山羊，這標(biāo)志著我省在轉(zhuǎn)基因動物研究領(lǐng)域取得了重要突破。為探索建立自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)，以及給下一步研制轉(zhuǎn)人αLA基因的山羊奠定了基