鵝肥肝生成相關(guān)miRNAs、基因的鑒定及功能研究和就巢性相關(guān)miRNAs的鑒定.pdf

1、較強的就巢性和肝臟脂肪酸合成與儲存能力是鵝的兩大特點。miRNAs可以對基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。浙東白鵝為江浙一帶主要的鵝地方品種，具有強烈的就巢性。朗德鵝肝臟具有很強的脂肪酸合成能力與儲存能力，是生成鵝肥肝的主要鵝品種。本試驗通過高通量測序技術(shù)分別研究了與浙東白鵝就巢性狀相關(guān)和與朗德鵝肥肝形成相關(guān)的miRNAs。除此以外，對朗德鵝肝臟脂肪代謝機理進(jìn)行了更深一步的研究。包括采用RNA-Seq技術(shù)對正常飼養(yǎng)的朗德鵝和填飼朗德鵝的肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)

2、錄組測序;選擇測序結(jié)果中差異表達(dá)的基因中與肝臟脂肪酸合成相關(guān)的基因，對其序列進(jìn)行擴(kuò)增;并對這些基因的組織特異性進(jìn)行了分析;最后在細(xì)胞水平研究了硬脂酸、亞油酸、葡萄糖和胰島素對這些基因表達(dá)的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1、與浙東白鵝就巢性狀相關(guān)miRNAs的研究
　　鵝就巢行為主要受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控。運用高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，我們對處于就巢期和產(chǎn)蛋期浙東白鵝下丘腦中miRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行了分析。在就巢組和

3、產(chǎn)蛋組鵝下丘腦中，我們分別獲得了11053784條序列和8801405條序列。在這些小RNA序列中，miRNAs在其中所占的比例最高，分別在就巢組和產(chǎn)蛋組中占小RNA總數(shù)的75.61％和79.82％。對這些小RNA的長度分布進(jìn)行分析得出22 nt的小RNA所占比例最高。下丘腦中表達(dá)量最高的miRNA家族為Let-7。對就巢組和產(chǎn)蛋組中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分析，我們鑒定出38種在就巢組中表達(dá)上調(diào)的miRNAs和14種表達(dá)下調(diào)的miR

4、NAs（至少在一個組中閱讀數(shù)大于1000，且變化倍數(shù)大于2，P＜0.001）。在這些差異表達(dá)的miRNAs中，miR-30d，miR-30e，miR-148a-3p，miR-30a和miR-146c在兩個試驗組中都具有很高的表達(dá)量。除了已知miRNAs外，我們還在下丘腦中發(fā)現(xiàn)158種新miRNAs，包括在就巢組發(fā)現(xiàn)的114種新miRNAs和產(chǎn)蛋組中發(fā)現(xiàn)的94種新miRNAs。我們列出了其中12種閱讀數(shù)至少在一組中大于100的新miRNA

5、s。在這12種新miRNAs中，有1種在就巢組中表達(dá)顯著下調(diào)，有3種在就巢組中表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2、與朗德鵝肥肝形成相關(guān)的miRNAs的研究
　　朗德鵝肝臟具有很強的脂肪酸沉積能力。經(jīng)過21 d填飼后，與正常飼喂朗德鵝相比，其在體重增加了1.5倍的同時，肝重增長了4倍。組織學(xué)觀察可在肝臟中觀察到大量的脂滴。通過高通量測序和生物信息學(xué)分析，我們分別在正常肝和肥肝中檢測出10396977條和11321273條序列，這其中分別有

6、88.92％和86.98％的序列為miRNAs。對小RNAs的長度分布分析得出22 nt的小RNAs所占比例最高。miR-122在肝臟中的表達(dá)量非常高，在對照組和填飼組中分別占miRNA總量的70.34％和72.01％，但miR-122在兩個試驗組間表達(dá)無顯著性差異。與對照組肝臟相比，我們在肥肝中鑒定出22個表達(dá)上調(diào)的miRNAs和12個表達(dá)下調(diào)的miRNAs(歸一化表達(dá)量至少在一組中大于100.0，改變倍數(shù)大于2且P＜0.001)。m

7、iR-222和miR-30d分別為上調(diào)和下調(diào)的miRNAs中表達(dá)量最高的。在鵝肝臟中，我們共鑒定出67種新miRNAs，其中有3種在兩組間差異表達(dá)（至少在一組中歸一化表達(dá)量大于10.0，且變化倍數(shù)大于2，P＜0.001）。在miR-125b對預(yù)測靶基因ACSL1的miRNA/mRNA相互作用的驗證試驗中，轉(zhuǎn)入miR-125bmimic與轉(zhuǎn)入陰性對照相比，構(gòu)建的ACSL1基因3'-UTR的熒光素酶活性降低為陰性對照組的57.3％。

8、　　3、運用RNA-Seq技術(shù)分析朗德鵝填飼后轉(zhuǎn)錄水平的變化情況
　　運用RNA-Seq技術(shù)分析正常飼喂與填飼朗德鵝肝臟的轉(zhuǎn)錄組，我們分別在對照組和填飼組肝臟中獲得了50198914條和49172954條reads。與參考基因組比對上的reads分別在兩組占了52.85％和48.74％。與參考基因比對上的reads分別在兩組中占總reads的36.61％和32.88％。兩個試驗組中存在最多的可變剪接類型為3'端可變剪接，其次為5'

9、端可變剪接。以FADS2基因為例，我們共檢測到5種可變剪接。對兩個試驗組中基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較，我們在填飼組鵝肥肝中共檢測到602個表達(dá)上調(diào)的基因和200個表達(dá)下調(diào)的基因。在這些差異表達(dá)的基因中，我們篩選出與糖類代謝和脂類代謝相關(guān)的33個表達(dá)上調(diào)的基因和13個表達(dá)下調(diào)的基因。在這些基因中，表達(dá)下調(diào)的基因ACSL1，HMGCS1與表達(dá)上調(diào)的基因PDGDS，CYP2C45，ADS1，ADS1，Elovl6，17β-HSD，F(xiàn)AS，ACS，

10、SCD1在肝臟都有很高的表達(dá)水平。
　　4、脂肪酸合成相關(guān)基因的克隆與組織表達(dá)
　　本試驗克隆的ACSL1基因cDNA序列共3709 bp，其中包括119 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR)，2097 bp的編碼區(qū)（CDS區(qū)）和1493 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)。CDS序列編碼699個氨基酸，與鴨和雞同源性分別為98.14％和93.71％。在填飼后，肝臟和腎臟中ACSL1基因表達(dá)顯著下調(diào)，腹脂和心臟中ACSL1基因

11、表達(dá)顯著上調(diào)。與對照組相比，肝臟中SCD1基因表達(dá)量在填飼后增長了22.23倍，在胸肌、腿肌和腹脂中表達(dá)量也顯著上升。本試驗克隆的Elovl6基因cDNA片段序列共2782 bp。其中包括74 bp的5'-UTR，798 bp的CDS區(qū)和1909 bp的3'-UTR。CDS共編碼了266個氨基酸，與雞氨基酸序列的同源性為98.49％。填飼后，肝和脾中Elovl6的表達(dá)量顯著升高，分別增長了2.04倍和6.02倍。擴(kuò)增的FADS1基因cD

12、NA全序列全長3147bp，其中包括314 bp的5'-UTR區(qū)，1083 bp的CDS區(qū)和1750 bp的3'-UTR區(qū)。CDS區(qū)編碼361個氨基酸，氨基酸序列與鴨的同源性為98.61％，而與雞只有79.14％。填飼后，該基因在肝臟和脾中的表達(dá)量分別增長了2.61倍和2.89倍。克隆的鵝FADS2基因CDS序列全長1335bp，共編碼445個氨基酸，與鴨和雞的同源性分別為97.07％和93.69％。填飼后，肝臟中FADS2基因的表達(dá)量

13、增加了3.09倍。
　　5、硬脂酸、亞油酸、葡萄糖和胰島素對鵝原代肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　通過不同濃度的硬脂酸(SA)、亞油酸(LA)、葡萄糖和胰島素處理鵝原代肝細(xì)胞24 h，檢測細(xì)胞脂質(zhì)積累情況和脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，與對照組相比，低濃度的SA和LA(50μM和100μM)可以誘導(dǎo)細(xì)胞月旨肪沉積，而高濃度(150μM)對細(xì)胞脂肪沉積無顯著影響。低濃度的葡萄糖和胰島素對細(xì)胞脂肪

14、沉積影響較小，而高濃度葡萄糖（100mM）和胰島素(200 nM)對其具有較強的刺激作用。不同濃度SA都可以刺激FAS, FADS1和Elovl5基因表達(dá)，100μM的SA可以刺激ACSL1表達(dá)，150μM的SA使SCD1基因表達(dá)上調(diào)。不同濃度的LA可以刺激FAS, FADS1，Elovl5和ACSL1的表達(dá)，50μM的LA可以上調(diào)FADS2表達(dá)。不同濃度的葡萄糖可以誘導(dǎo)FAS，Elovl5表達(dá)，50 mM和100mM的葡萄糖可以刺激S