奶牛乳腺組織miRNAs表達(dá)譜及基因BOLA-DQA2剪接體相關(guān)miRNAs分析.pdf

1、乳腺炎是現(xiàn)代奶牛業(yè)中一種常見的、復(fù)雜的炎癥性疾病，可造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。它受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響，在其發(fā)生過程中有多種免疫相關(guān)基因參與。迄今為止，有關(guān)乳腺炎抗性分子機(jī)制尚不明了，特別是抗性相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚。MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約22nt的內(nèi)源性、非編碼RNAs，它可負(fù)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，在免疫反應(yīng)過程中有著重要作用;可變剪接(alternative splicing，AS)是在基因轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基

2、因的一種調(diào)控機(jī)制，對(duì)基因生物功能的發(fā)揮有調(diào)控作用。為了探索在乳腺炎發(fā)生過程中，miRNA和可變剪接對(duì)免疫相關(guān)基因BOLA-DQA2的調(diào)控機(jī)制，以期了解乳腺炎的發(fā)病機(jī)理，豐富對(duì)奶牛乳腺炎抗性的認(rèn)識(shí)。本文初步研究了miRNAs和可變剪接體與乳腺炎的關(guān)系。本論文分以下三部分:一奶牛乳腺組織miRNAs表達(dá)譜分析
　　 在真核細(xì)胞中，miRNA對(duì)基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用。近年來，已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了許多的miRNAs。為了擴(kuò)展miRNA

3、數(shù)量和分析乳腺組織miRNA表達(dá)與乳腺炎的潛在關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采用Solexa測(cè)序方法檢測(cè)了患乳腺炎奶牛的乳腺組織miRNAs的表達(dá)譜，然后利用生物信息學(xué)的方法注釋miRNAs序列，結(jié)果共檢測(cè)出375個(gè)miRNAs序列，其中230個(gè)miRNAs為miRNA數(shù)據(jù)庫中已知的，145個(gè)為新miRNAs;鑒定出了1個(gè)新mirton和1個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄miRNA。新發(fā)現(xiàn)的miRNAs可能為乳腺炎組織特異性表達(dá)的，可能在奶牛乳腺炎發(fā)生的過程中起著重要的作用。

4、本研究豐富了牛miRNAs數(shù)據(jù)庫，這些結(jié)果將促進(jìn)哺乳動(dòng)物基因組的功能注釋和miRNAs功能與比較基因組學(xué)的研究。
　　 二奶牛BOLA-DQA2基因可變剪接體與功能性SNPs的鑒定
　　 主要組織相容性復(fù)合體二類基因（MHC，major histocompatibility complex）在牛上也叫BOLA-DQA2，它參與免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了探討B(tài)OLA-DQA2基因變異與奶牛乳腺炎抗性的關(guān)系，通過RT-PCR、克隆測(cè)

5、序及序列比對(duì)的方法，在奶牛乳腺組織鑒定出兩種BOLA-DQA2基因剪接體。其中，一種剪接體與NCBI參考序列一致，命名為BOLA-DQA2-complete;新的剪接體命名為BOLA-DQA2-SV1。剪接體BOLA-DQA2-SV1在exon3缺少195bp、在3'-UTR區(qū)缺少52bp和167bp。BOLA-DQA2-SV1通過提前引入終止密碼子，編碼了一個(gè)潛在的含有255個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。序列比對(duì)還鑒定出13個(gè)新的單核苷酸多態(tài)性(

6、SNPs)和多核苷酸多態(tài)性（MLNPs），其中4個(gè)SNPs和MLNPs導(dǎo)致蛋白潛在的保守區(qū)的氨基酸突變，且一個(gè)SNP(c.+1283C＞T)發(fā)生在bta-miR-2318種子序列區(qū)結(jié)合的區(qū)域，可能會(huì)影響bta-miR-2318與靶基因的結(jié)合。兩種剪接體在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺組織中均有表達(dá)。在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺組織中，BOLA-DQA2-SV1的表達(dá)量均顯著高于BOLA-DQA2-complete的表達(dá)量，表明BOLA-DQA2

7、-SV1是BOLA-DQA2基因的主轉(zhuǎn)錄本。BOLA-DQA2-SV1在患乳腺炎奶牛乳腺中的表達(dá)量呈2.67倍上調(diào)(p＜0.05)。上述結(jié)果提示，BOLA-DQA2-SV1可能在奶牛乳腺炎抗性方面扮演著重要的角色，而SNPs是否會(huì)影響B(tài)OLA-DQA2基因的結(jié)構(gòu)以及它們與奶牛乳腺炎的關(guān)系還需做進(jìn)一步研究。
　　 三 BOLA-DQA2基因不同剪接體靶標(biāo)miRNAs的表達(dá)分析
　　 應(yīng)用靶標(biāo)miRNA預(yù)測(cè)軟件分析了與BOL

8、A-DQA2基因兩種剪接體的3'-UTR結(jié)合的miRNAs，并利用莖環(huán)-熒光定量PCR(Stem-loop-Q-PCR)分析了5個(gè)候選靶miRNAs在健康(n=5)和患乳腺炎奶牛(n=5)乳腺組織中的表達(dá)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，靶向BOLA-DQA2-SV1基因的miRNAs數(shù)量比BOLA-DQA2-complete少;熒光定量結(jié)果表明，在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中，5個(gè)潛在靶向BOLA-DQA2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的miRNAs中，除了bta-miRNA