Galetin-3誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肝樣分化過程中Wnt-β-catenin的表達(dá)特征.pdf

1、急性肝衰竭(Acute hepatic failure，AHF)是指由肝炎病毒感染、藥物中毒等各種原因?qū)е露虝r(shí)間內(nèi)肝臟細(xì)胞大面積壞死，進(jìn)而使肝臟合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生障礙或失代償，出現(xiàn)以黃疸、腹水、肝性腦病等肝功能嚴(yán)重障礙而導(dǎo)致的臨床綜合征。近年來干細(xì)胞生物學(xué)的興起特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療研究的開展給急性肝衰竭患者的治療帶來了新的希望。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenc

2、hymal stem cells，BMSCs)是骨髓中除了造血干細(xì)胞外的另一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的可塑性，在一定刺激條件下可以跨越胚層橫向分化為多種組織細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、脂肪樣細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及肝樣細(xì)胞等。雖然BMSCs在機(jī)體骨髓中含量很低，并且細(xì)胞的數(shù)量會(huì)隨著機(jī)體年齡增加或體質(zhì)衰弱逐漸減少，但其在體外可以大量擴(kuò)增，同時(shí)可以經(jīng)過特定條件誘導(dǎo)定向分化為肝樣細(xì)胞從而參與肝臟的組織損傷修復(fù)、細(xì)胞更新

3、、功能重建等病理生理過程，此外還具有自體供源、避免免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)，在肝病治療中和肝臟組織工程領(lǐng)域都具有巨大應(yīng)用潛能，利用其多向分化的能力治療急性肝衰竭有著非常廣闊的前景。而如何高效誘導(dǎo)BMSCs向肝樣細(xì)胞分化成為各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)，這一問題的解決也是干細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床肝病治療的關(guān)鍵。但近年來對(duì)BMSCs向肝樣細(xì)胞定向分化潛能的研究多集中在其分化特性上，對(duì)其分化機(jī)制的研究尚處于初步階段，且在體外誘導(dǎo)劑方面進(jìn)展甚少，干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用遠(yuǎn)

4、未達(dá)到預(yù)期效果。因此探究BMSCs向肝樣細(xì)胞分化的分子機(jī)制及尋找新的高效誘導(dǎo)分化的方法意義重大。
　　目前研究已經(jīng)證實(shí)干細(xì)胞生存的微環(huán)境直接影響與決定著其向成體干細(xì)胞的分化方向。因此越來越多的學(xué)者將微環(huán)境的研究作為各類干細(xì)胞定向分化機(jī)制研究的突破口和切入點(diǎn)。本課題組前期從大鼠急性肝功能衰竭的微環(huán)境這一“全景范圍”入手，利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative andabsolute qua

5、ntitation，iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功篩選出了大鼠肝損傷組織內(nèi)微環(huán)境與正常肝組織微環(huán)境的差異蛋白，并通過蛋白組學(xué)相關(guān)軟件及生物信息學(xué)等方法從上述差異蛋白中篩選出BMSCs誘導(dǎo)分化過程中可能起作用的“關(guān)鍵”蛋白半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)，進(jìn)一步通過誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證明了Gal-3能夠誘導(dǎo)大鼠BMSCs向肝樣細(xì)胞分化，說明了Gal-3是一個(gè)非常有潛力的強(qiáng)有力的促進(jìn)BMSCs向肝樣細(xì)胞分化的因子。然而，該誘導(dǎo)

6、過程涉及的有關(guān)信號(hào)通路分子機(jī)制尚未明確，探究這一問題有助于進(jìn)一步挖掘Gal-3誘導(dǎo)BMSCs肝樣分化的能力。
　　半乳糖凝集素-3是半乳糖凝集素家族中特殊的一員，廣泛表達(dá)于正常組織和腫瘤組織中，主要存在于胞質(zhì)中，在胞膜上及胞外基質(zhì)中也有，通過特殊的氨基端結(jié)構(gòu)和帶有糖識(shí)別域的羧基端參與多種生理和病理過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、細(xì)胞粘附、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、新生血管形成和腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等。大量研究表明Gal-3在多種細(xì)胞的再生和組織修復(fù)過程中

7、發(fā)揮重要作用，特別是與肝細(xì)胞的再生關(guān)系密切，而確切的作用機(jī)制仍未見報(bào)道，結(jié)合我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)可能與干細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。而BMSCs分化為肝樣細(xì)胞是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞因子、胞內(nèi)外蛋白、胞外基質(zhì)等相互作用以及多個(gè)信號(hào)通路的交叉調(diào)控，目前普遍認(rèn)為Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Hh信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等參與了BMSCs肝樣分化過程的調(diào)控，并發(fā)揮重要作用。其中的Wnt

8、/β-catenin信號(hào)通路與間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及分化密切相關(guān)，通過不同程度地調(diào)控WNT信號(hào)基因的表達(dá)，在一定條件下可以促使間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝樣細(xì)胞等分化。
　　Wnt信號(hào)途徑廣泛存在于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，是一類在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路，最常見的是Wnt/β-catenin信號(hào)通路。該通路主要由胞外的Wnt信號(hào)分子、胞膜上的受體、胞質(zhì)中的一個(gè)動(dòng)態(tài)降解復(fù)合體APC-Axin-GS

9、K-3β復(fù)合物、關(guān)鍵蛋白β-catenin、下游轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef等組成。在Wnt信號(hào)缺失時(shí)，胞質(zhì)中的β-catenin主要被GSK-3β復(fù)合體磷酸化進(jìn)而被泛素化降解，從而維持胞質(zhì)中β-catenin低水平狀態(tài)，通路處于關(guān)閉狀態(tài);當(dāng)Wnt信號(hào)分子與胞膜上特異性結(jié)合后可形成Wnt-Frizzled復(fù)合體結(jié)構(gòu)，抑制下游GSK-3β磷酸化活性，使胞質(zhì)中β-catinin積累并核內(nèi)轉(zhuǎn)移激活轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控等作用。當(dāng)前已有研究表明，G

10、al-3與Wnt信號(hào)通路關(guān)系密切，其在結(jié)構(gòu)和功能上與通路上的重要分子Axin、GSK-3β、β-catenin等極相似，甚至有學(xué)者指出Gal-3極有可能就是Wnt/β-catenin信號(hào)通路上與β-catenin功能類似的重要調(diào)控因子。因此，我們推測(cè)在Gal-3誘導(dǎo)大鼠BMSCs定向分化為肝樣細(xì)胞過程中，經(jīng)典Wnt通路可能也占據(jù)著至關(guān)重要的角色，對(duì)Gal-3誘導(dǎo)大鼠BMSCs向肝樣細(xì)胞定向分化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)

11、特征的研究可對(duì)此假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，由此為Gal-3和BMSCs在肝病的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的:
　　探尋Gal-3誘導(dǎo)大鼠BMSCs向肝樣細(xì)胞定向分化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)的相關(guān)分子影響機(jī)制，為Gal-3和干細(xì)胞移植在臨床上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)性研究。
　　方法:
　　1.SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代分離培養(yǎng)及鑒定:頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)SD大鼠，收集股骨干和脛骨干中骨髓液，聯(lián)合采用密

12、度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法，分離出骨髓液中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng);取第4代貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志分子進(jìn)行檢測(cè)鑒定，說明已成功獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.Gal-3誘導(dǎo)大鼠BMSCs肝樣分化過程中WNT信號(hào)通路重要分子表達(dá)特征的檢測(cè):取第4代BMSCs，用預(yù)先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml Gal-3的完全培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2天換液一次。實(shí)驗(yàn)按照誘導(dǎo)不同階段分5組，分別為0d組、7d

13、組、14d組、21d組、28d組，提取各組總RNA、總蛋白質(zhì)，采用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)Wnt1、Wnt3a、GSK-3β、β-catenin四個(gè)基因的mRNA水平表達(dá)情況，western blot檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá)情況，其中0d組作為參照組。
　　3.Wnt信號(hào)通路阻滯劑和激動(dòng)劑作用效果檢測(cè):取第4代BMSCs細(xì)胞，分別加入含含有Gal-3+DKK-1、Gal-3+SB216763的完全培養(yǎng)液，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)28d。分別

14、于第0d、7d、14、21d、28d在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照，然后提取總RNA、總蛋白質(zhì)，采用Q-PCR檢測(cè)AFP、ALB兩個(gè)基因的表達(dá)，其中0d時(shí)間點(diǎn)作為參照組。western blot檢測(cè)β-catenin、ALB兩個(gè)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　分離出的SD大鼠BMSCs培養(yǎng)24h后，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，并呈集落狀生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，每個(gè)集落中細(xì)胞不斷分裂增殖，形態(tài)呈漩渦狀生長(zhǎng)，外觀似成纖維樣細(xì)胞，

15、呈長(zhǎng)梭形，有偽足，排列有明顯的方向性，各個(gè)集落逐漸融合。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子結(jié)果顯示CD29、CD44和CD90表達(dá)陽性，造血系干細(xì)胞標(biāo)記分子CD34和CD45表達(dá)不明顯，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性。通過分別檢測(cè)Gal-3誘導(dǎo)大鼠BMSCs肝樣分化過程不同時(shí)段四個(gè)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各不同時(shí)間組的Wnt1、Wnt3a、GSK-3β和β-catenin的mRNA表達(dá)存在顯著差異(P＜0.01);同時(shí)，除了Wnt1的

16、21d組與14d組(P=0.07)、GSK-3β的7d組與0d組(P=0.616)、28d組與21d組(P=0.616)外，其余各基因mRNA的表達(dá)量都與前一時(shí)間點(diǎn)存在顯著差異(P＜0.05)，總得來看，Wnt1、Wnt3a、β-catenin表達(dá)呈現(xiàn)逐漸上調(diào)趨勢(shì)，而GSK-3β則呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，Western blot檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，與mRNA表達(dá)水平一致。在分別加入DKK-1和SB216763后，隨著誘導(dǎo)時(shí)

17、間的延長(zhǎng)，β-catenin蛋白水平在兩組的表達(dá)趨勢(shì)是逐漸上調(diào)的，且同一時(shí)間點(diǎn)的SB216763組與DKK-1組相比差異顯著(P＜0.05)，前者較后者上調(diào)幅度大。ALB蛋白水平表達(dá)結(jié)果同β-catenin情況大體類似。檢測(cè)兩組AFP和ALB mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，除了DKK-1組在14d時(shí)ALB和AFP的表達(dá)有輕微下調(diào)外，兩組在AFP和ALB mRNA水平的表達(dá)大體呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，且在培養(yǎng)到14d后，同一時(shí)間點(diǎn)其

18、中SB216762組表達(dá)AFP和ALB的量遠(yuǎn)高于DKK-1組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法的結(jié)合可成功分離純化出SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其細(xì)胞表面CD29、CD44和CD90表達(dá)陽性，不表達(dá)CD34和CD45; Gal-3誘導(dǎo)SD大鼠BMSCs肝樣分化與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，SB216763與Gal-3起協(xié)同激活通路促進(jìn)分化作用，而DKK-1能一定程度拮抗通路