25型藍知病病毒VP7和VP2蛋白的原核表達及其單克隆抗體的制備.pdf

1、藍舌病(Bluetongue，BT)是由藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的，依靠媒介昆蟲（庫蠓、伊蚊等）在反芻動物之間傳播的一種烈性非接觸性的傳染病。純種細毛羊對該病最敏感。BT最早于1876年被發(fā)現(xiàn)，目前在熱帶和溫帶的多個國家都已分離到BTV，并且該病的分布范圍在不斷的擴大，呈現(xiàn)全球性分布的趨勢。我國于1979年第一次發(fā)現(xiàn)該病的存在，目前在我國29個省份已檢測到感染BTV陽性的病畜。迄今為止，全世界范圍內共分

2、離到26種不同血清型的BTV，且不同的血清型之間無交叉保護作用。
　　BTV基因組由10個雙鏈RNA組成，包括大片段(L1-L3)、中片段（M4-M6）和小片段(S7-S10)。其共編碼7個結構蛋白(VP1-VP7)和4種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)。VP7是由S7基因編碼的主要結構蛋白，由349個氨基酸組成，位于病毒核衣殼的表面，約占病毒核心蛋白總量36％。VP7是BTV的群特異性抗原，不同血清型之間的

3、VP7蛋白的同源性高達94％。VP2由L2基因編碼，在不同血清型病毒間保守性最低。VP2蛋白主要參與病毒的吸附和進入，與病毒的毒力有關。VP2可誘導產生中和抗體，是BTV型特異性抗原主要的決定因素。25型BTV是2008年從瑞士山羊血液樣本中分離獲得。25型BTV的VP2與其他血清型病毒VP2的同源性僅為23％-79％。因感染25型BTV的牲畜無典型癥狀，故常被忽略。但是一旦爆發(fā)，發(fā)病率和死亡率較高。因此建立針對25型BTV的特異性血清

4、學檢測方法對BTV的防控有重要的意義。
　　本研究為制備25型BTV的VP7和VP2蛋白單克隆抗體(Monoclonal antibody，McAb)，利用原核表達系統(tǒng)pET-28a(+)和pGEX-6P-1表達VP7蛋白，分別命名為VP7a和VP7p。經SDS-PAGE和Western blot分析大小依次為44 kDa和64 kDa，與預期蛋白大小一致。采用原核表達系統(tǒng)pET-28a(+)和pMAL-c5X部分重疊表達三段VP

5、2蛋白，分別命名為VP2-A、VP2-B、VP2-C和VP2-A1、VP2-B1、VP2-C1。經SDS-PAGE和Western blot分析，大小依次為50kDa、48kDa、48kDa、84 kDa、82 kDa和82 kDa，與預期蛋白大小一致。分別將重組蛋白VP7a和重組VP2-A、B、C作為免疫抗原，腹腔免疫BALB/c小鼠，采用細胞融合技術將骨髓瘤細胞SP2/0與免疫后小鼠的脾細胞進行細胞融合，通過有限稀釋法進行細胞亞克隆

6、，獲得穩(wěn)定產生抗體的雜交瘤細胞。分別以VP7p和VP2-A1、B1、C1蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA方法進行McAb的篩選。共獲得5株穩(wěn)定分泌抗25型BTV VP7的雜交瘤細胞株，分別命名為3H7、5F12、6E10、6G11和1C8;同時篩選出2株針對VP2蛋白的雜交瘤細胞株，分別命名為2E7和5B3。經抗體亞類試劑盒鑒定除1C8為IgM外，其余各株皆為IgG。2E7和5B3經抗體亞類試劑盒鑒定分別為IgG1和IgG2b。經連

7、續(xù)傳代并凍存復蘇后，以上7株雜交瘤細胞皆可穩(wěn)定分泌抗體，具有良好的穩(wěn)定性。間接免疫熒光鑒定結果顯示，3H7可與8型BTV發(fā)生特異性結合，其余各株皆不發(fā)生反應，說明該株單抗能夠特異性地識別8型BTV，且不與赤羽病病毒(AKAV)、茨城病毒(IBAV)、豬輪狀病毒(PRV)發(fā)生交叉反應，表明單抗具有良好的特異性。Western blot結果證明，3H7單抗能識別重組VP7蛋白;2E7和5B3可特異性識別重組VP2蛋白?？乖砦化B加試驗結果表