雞傳染性法氏囊病毒VP4、VP5蛋白在感染中對宿主天然防御能力的影響研究.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一種由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease，IBDV)引起的雞的急性、高度接觸性傳染病，病毒感染會引起雞的免疫抑制，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大危害。VP4、VP5蛋白是法氏囊病毒基因組編碼的兩種重要非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的感染中有重要的作用。
　　1.雞傳染性法氏囊病毒的VP4、VP5蛋白對病毒感染引起的免疫抑制作用研究
　

2、　為探討IBDV VP4、VP5蛋白在病毒感染引起的免疫抑制中的作用，本研究將構(gòu)建了VP4、VP5蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，并用Poly IC刺激或IBDV CV03病毒株感染轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，Western-blot方法檢測細(xì)胞中模式識別受體及下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá);熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子及抗病毒基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，VP4蛋白能夠促進(jìn)TLR3 mRNA的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達(dá)，尤其是在Poly IC刺激或IBDV CV03病毒感染

3、后刺激作用更顯著;而VP5蛋白對TLR3 mRNA與蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出顯著抑制作用;IBDV CV03毒株感染能夠刺激TLR3 mRNA的大量表達(dá)，但其蛋白表達(dá)水平卻很低。VP4、VP5蛋白在IBDVCV03毒株感染時都顯著抑制MDA5蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步檢查下游的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)，VP4、VP5蛋白均能促進(jìn)IRF3蛋白的表達(dá)，但在CV03毒株感染后均表現(xiàn)出抑制作用;VP5還能顯著抑制IRF7蛋白的表達(dá);VP5蛋白能夠抑制I型IFNmRNA的轉(zhuǎn)

4、錄，對白細(xì)胞介素IL-Iβ、IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)都有一定的抑制作用。另外，CV03毒株的感染整體上顯著抑制了抗病毒蛋白Mx基因的表達(dá)。結(jié)果表明，IBDV可通過VP5蛋白抑制模式識別受體TLR3 mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)，阻止信號向下游傳遞，也可通過抑制MDA5蛋白的表達(dá)來實現(xiàn);對模式識別受體下游轉(zhuǎn)錄因子的檢測結(jié)果說明，IBDV對機(jī)體的免疫抑制作用可通過抑制IRF3蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)的，而對IRF3蛋白表達(dá)的抑制作用主要由IBDV

5、的VP4和VP5蛋白共同執(zhí)行;另外IBDV也通過VP5抑制IRF7 mRNA的轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達(dá)來達(dá)到免疫抑制作用。IBDV與DF-1細(xì)胞互作過程中的免疫抑制作用主要通過VP5蛋白來實現(xiàn)，VP4起輔助作用。
　　2.VP4、VP5蛋白在雞傳染性法氏囊病毒感染過程中對非干擾素通路的影響
　　為探討VP4、VP5蛋白在雞傳染性法氏囊病毒感染過程中對宿主非干擾素通路的影響，本研究將所構(gòu)建的VP4、VP5蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染I型干擾

6、素表達(dá)缺陷型細(xì)胞Vero細(xì)胞，并用IBDV CV03病毒株感染轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，Western-blot方法檢測細(xì)胞中模式識別受體及其下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá);熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子及抗病毒基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，VP4蛋白在IBDV CV03病毒感染后在一定程度上能夠提高TLR3、RIG-I的蛋自含量但差異不顯著;VP5對TLR3、RIG-I等介導(dǎo)的天然免疫通路有一定的抑制作用;過表達(dá)的VP5在IBDV CV03病毒感染后顯著抑制了IRF3的

7、表達(dá)及其磷酸化水平，也顯著抑制了IRF7和NF-κB的表達(dá)，并在抑制NF-κB后抑制了TNF-α，而過表達(dá)VP4無此作用。結(jié)果說明，VP5蛋白對相關(guān)信號通路（宿主的非I型干擾素產(chǎn)生途徑）有一定的抑制作用，這種抑制作用和核轉(zhuǎn)錄因子及TNF-α的抑制密切相關(guān)。另一方面，VP4和VP5蛋白在Vero細(xì)胞中的過表達(dá)對IBDV的感染和復(fù)制的影響目前還不清楚，有待我們進(jìn)一步的研究探討。
　　3.VP4、VP5蛋白對病毒感染引起的細(xì)胞損傷的影響

8、
　　為探討VP4、VP5對IBD病毒感染引起的細(xì)胞損傷的影響，本研究通過流式細(xì)胞檢測技術(shù)，觀察VP4、VP5蛋白表達(dá)后（或有Poly IC刺激或有IBDV CV03毒株感染）DF-1細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，并用試劑盒檢測DF-1細(xì)胞內(nèi)SOD和NAG酶的活性以及細(xì)胞內(nèi)LD的含量。結(jié)果顯示，VP4、VP5蛋白均能刺激DF-1細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，同時SOD活性顯著增加，LD含量增加;當(dāng)有Poly IC刺激或IBDV CV03毒株感染時，活性