SRPK1在TGF-β介導的食管鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡中的作用.pdf

1、到目前為止，TGF-β-SRPK1在ESCC中的確切作用仍不清楚。為探究SRPK1在TGF-β介導的食管鱗狀細胞癌細胞生物學過程中的作用和意義，我們應用免疫組化法、免疫印跡法及RT-PCR法檢測120例食管鱗狀細胞癌樣本及細胞系中SRPK1的表達水平。并在體外實驗中，檢測加入TGF-β作用后的食管鱗狀細胞癌細胞中的SRPK1的表達水平，從而分析并總結SRPK1在ESCC組織和細胞中的表達譜及其生物學作用，著重于探究發(fā)展有效的抗-SRPK

2、1治療方法的臨床價值和優(yōu)勢。
　　第一部分 SRPK1在食管鱗癌中的表達及臨床意義
　　目的：
　　本研究通過應用免疫組織化學以及基因和蛋白檢測方法觀察SRPK1在食管癌組織及正常食管組織中的表達，并分析其在食管癌發(fā)生和發(fā)展及腫瘤轉移、病理分級、臨床分期中的關系，探討SRPK1可能作為致癌基因在食管癌的診斷和治療的臨床價值，為其治療提供新的靶點。
　　方法：
　　本實驗選取山東省腫瘤醫(yī)院及山東省醫(yī)學科學院附

3、屬醫(yī)院胸外科自2008年10月至2010年6月收治的120例食管癌病人，病人均經過手術治療，切除的食管癌標本經兩名病理科醫(yī)師獨立診斷證實。標本中癌組織作為實驗組，相應標本的上切緣組織即距腫瘤5cm以上的正常食管組織作為實驗對照組進行配對分組研究。應用免疫組織化學法檢測SRPK1蛋白在食管癌組織及與其配對正常組織中表達的差異，探討其在腫瘤演生、進展過程中的作用。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，SRPK1與食管癌臨床病

4、理因素之間的分析采用行卡方檢驗。以a=0.05作為統(tǒng)計學檢驗水準。
　　結果:
　　1.SRPK1在ESCC組織中的表達
　　免疫組化染色表明，在120例ESCC組織中，有65例顯示了高SRPK1表達，而在這65例ESCC組織中，SRPK1蛋白主要在細胞質和細胞核中表達，其中包括29例(++)和31例(+++)。然而，在癌周正常組織中則很少出現SRPK1染色。此外，SRPK1 mRNA的表達水平在腫瘤組織中明顯增高。與

5、無癌轉移的食管組織相比，在有癌轉移的ESCC樣本中SRPK1 mRNA及蛋白的表達水平均顯著升高。
　　2.SRPK1與腫瘤臨床病理特點之間的關系
　　SRPK1的表達與腫瘤臨床分期及腫瘤大小無明顯相關性。相反，SRPK1的表達量與ESCC的轉移之間具有顯著相關性，其差異具有的統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。
　　3.SRPK1表達水平與ESCC病人預后的關系 Kaplan-Meier生存曲線顯示SRPK1表達水平與總生

6、存率偏低密切相關(p＜0.000)。另外，單因素分析結果證實，SRPK1高表達的病人發(fā)生死亡的風險顯著升高(p＜0.001)。同時，單因素分析結果還顯示，ESCC轉移性與不良預后有關，然而，患者的年齡、性別和腫瘤侵襲深度與預后之間無關聯。多因素分析結果也顯示，SRPK1表達可作為預測ESCC病人預后的獨立預測因子(p＜0.001)。
　　結論:
　　SRPK1蛋白在食管癌組織中的陽性表達率高于正常食管組織。SRPK1蛋白的陽

7、性表達與臨床分期及腫瘤大小無明顯相關性，與ESCC的轉移之間具有顯著相關性。SRPK1表達水平與總生存率偏低密切相關，且高表達的ESCC患者的死亡風險明顯增高，因此，SRPK1的表達可作為預測ESCC患者預后的獨立預測因子。
　　第二部分 SRPK1在TGF-β介導的食管鱗癌細胞的增殖和凋亡中的作用
　　目的:
　　1.研究SRPK1在TGF-β介導的食管鱗狀細胞癌組織及細胞系的表達水平。
　　2.研究SRPK1

8、在TGF-β介導的食管鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡過程中的作用和意義。
　　3.探究SRPK1在TGF-β介導的食管鱗狀細胞癌組織及細胞中的生物學作用。
　　方法:
　　1.SRPK1-WT及SRPK1-KD質粒和腺病毒載體的構建
　　建立人ESCC細胞系EC109、TE8和TE2細胞，以進行相關的SRPK1的細胞水平檢測。野生型SRPK1(SRPK1-WT)的全長cDNA通過RT-PCR擴增正常食管上皮細胞mRN

9、A獲得，而SRPK1(SRPK1-KD)無活性激酶突變體則通過將第109位的賴氨酸催化突變?yōu)楸彼岖@得。隨后，將SRPK1-WT或者SRPK1-KD的cDNA插入pcDNA3.1(-)A-myc/his表達載體。通過AdEasyTM XL腺病毒載體系統(tǒng)構建腺病毒表達SRPK-WT或SRPK1-KD。
　　2.抗SRPK1質粒及siRNA轉染
　　質粒和siRNA均以脂質體2000為載體轉入細胞內，Western blot法檢

10、測轉染效率。應用Western blot及RT-PCR方法分別檢測EC109、TE8和TE2細胞系中SRPK1的表達，同時還應用Western blot法檢測細胞中AKT和JNK的磷酸化水平，從而評估SRPK1對TGF-β信號通路的潛在作用。
　　3.細胞增殖實驗檢測檢測SRPK1野生型及激酶失活型細胞的生存率，以探究SRPK1對細胞增殖的影響。
　　4.采用TUNEL實驗和免疫印跡方法探究SRPK1對ESCC細胞凋亡的影響

11、。并設計損傷愈合實驗和侵襲實驗以探究SRPK1在EC109細胞的轉移和侵襲過程的作用。
　　5.應用流式細胞術和Western blot法選擇EC109細胞系來研究SRPK1對細胞周期的調控作用及對調控因子的表達的影響。
　　結果:
　　1.SRPK1在ESCC細胞中的表達
　　在不同的細胞系中SRPK1的表達水平有所不同。SRPK1在TE2細胞系中表達水平最高，在EC109細胞系中表達水平最低。在EC109、T

12、E8和TE2細胞系中，SRPK1主要在細胞膜或者細胞質中表達。
　　2.SRPK1影響細胞增殖
　　野生型SRPK1可增強三種ESCC細胞系細胞的增殖作用，而激酶失活型則可抑制細胞增殖。同時，SRPK1基因沉默可顯著抑制腫瘤細胞增殖。
　　3.SRPK1影響細胞凋亡
　　SRPK1基因敲除的陽性細胞中，活化-caspase3和cyclin D1的表達水平升高，而在對照siRNA組則無增高(p＜0.01)。同時，經

13、si-SRPK1治療后，EC109細胞可出現凋亡相關的形態(tài)變化，如細胞萎縮變圓、細胞膜空泡化、細胞核斷裂凝結等。在TE8和TE2等其他ESCC細胞系中，si-SRPK1作用后的細胞也會出現相同的變化。
　　4.SRPK1調節(jié)AKT和JNK信號
　　與對照siRNA組相比，在si-SRPK1處理組，磷酸化-AKT在三種ESCC細胞系中的表達水平均顯著降低(p＜0.01)，而磷酸化-JNK的表達水平則明顯增高(p＜0.01)。<

14、br>　　5.SRPK1調控ESCC細胞的細胞周期、轉移和侵襲過程
　　EC109細胞周期G1期向S期轉化的過程受到SRPK1 siRNA的抑制。同時，與對照組相比，ESCC細胞中的cyclin D1和CDK2的表達水平也受到明顯抑制。損傷愈合實驗顯示，SRPK1 siRNA轉染后的EC109細胞的遷移性下降明顯。同樣，在侵襲實驗中，與未轉染組相比，SRPK1 siRNA轉染后的EC109細胞的侵襲性也受到明顯的抑制(p＜0.00